铜死亡的作用机制及在肝脏疾病中的研究进展

单关月,万 慧,张雨欣,史云鹏,李海军*

(1.吉林大学第一医院 肿瘤免疫实验室,吉林 长春130021;2.吉林大学中日联谊医院 肝胆胰外科,吉林 长春130033)

铜(Cu)是人体必须的微量元素,在线粒体呼吸、抗氧化防御和生物复合物合成等多种细胞生命过程中发挥重要辅助功能[1]。然而,生理条件下细胞内Cu浓度较低,Cu浓度小幅度升高可能引起细胞毒性,甚至导致细胞死亡[2]。细胞内铜的摄取、分布和消除等过程受到机体严格调控。基因突变导致Cu过量累积与多种致命性疾病的发生密切相关。因此,充分理解细胞内Cu积累和代谢机制对于疾病的治疗至关重要[3]。铜死亡是一种由Cu2+过度蓄积引发的细胞调控性死亡方式,不同于细胞凋亡、铁死亡和坏死[4]。铜死亡发生的过程如下:细胞内的Cu2+靶向结合三羧酸循环中的脂酰化成分-铜结合脂酰化成分聚集-铁硫蛋白簇继发性下降-蛋白毒性应激并最终导致细胞死亡。

肝脏是人体腹腔内最大的消化器官,承载着机体消化、代谢、解毒和免疫等重要生理功能[5]。肝脏疾病包括病毒性肝炎、酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝病、肝纤维化、肝硬化和肝癌。氧化应激反应失衡、免疫异常、代谢异常、基因突变等是其主要致病因素[6]。铜死亡相关研究逐渐成为热点,通过干预细胞铜死亡治疗肝脏疾病具有广阔前景。本文将围绕铜代谢和铜死亡相关信号通路,以及铜死亡介导的肝脏疾病发病机制展开综述,以期为铜死亡相关肝脏疾病的治疗提供新思路。

1 铜死亡

Cu是机体必须的微量元素,多种研究表明Cu对于维持机体多种生命活动代谢酶的活性具有重要意义[7]。因此机体内Cu浓度必须维持在相对狭窄范围内,才能保证机体正常的生理功能。细胞发生铜死亡的前提条件是细胞蓄积铜过量而未能有效代谢,因此本部分将从机体和细胞对Cu的代谢功能展开讨论。

1.1 机体内铜代谢

食物来源的Cu主要通过小肠和十二指肠吸收,小肠上皮细胞顶端的铜离子转运蛋白1(CTR1)调控Cu吸收[8]。Cu被胃肠道吸收后,被分泌到血液中,并与可溶性白蛋白、转运蛋白、组氨酸和巨球蛋白等结合成复合体,而后流经肝脏后通过CTR1被肝脏吸收[7]。在肝细胞质中,Cu可以被螯合到其它蛋白质中发挥酶活性,或经金属硫蛋白螯合后储存于肝细胞内[9]。铜ATP酶是一种离子泵,可以将肝脏内的Cu重新释放到血液中,继而结合伴侣蛋白或到达其它组织器官而发挥后续生理功能,包括线粒体能量、酪氨酸和神经递质代谢,氧化还原稳态和细胞外基质重塑[10]。

Cu进入机体后首先在肝脏内储存,过量的铜经胆汁途径最终通过粪便排出体外[11]。尿液、汗液和月经等其它途径能代谢少量铜。总之,机体内Cu主要通过十二指肠吸收,并通过胆汁排泄。当机体摄入Cu增加时,Cu吸收就会相应减少,而排泄增多;相反,当机体摄入Cu减少时,通过胆汁排泄Cu减少,铜Cu吸收增加,以此维持机体铜稳态[12]。

1.2 细胞内铜代谢的调控机制

为维持细胞水平上Cu稳态,细胞内复杂的Cu调控网络参与其中,包括铜酶、铜伴侣蛋白和细胞膜铜运输载体和通道。这些机制协同工作,共同调控细胞内Cu的摄取、排出和细胞内利用,以维持细胞内Cu浓度在安全的生理水平。细胞通过表面表达铜离子转运蛋白1(CTR1)摄取Cu进入细胞[13]。体外研究表明CTR1的表达受Cu浓度调控,当细胞外Cu浓度过量时,CTR1表达下降;相反,细胞外Cu浓度下降时,CTR1表达上调[14]。

在细胞质内,Cu的运输由高亲和力铜伴侣蛋白酶精细调控。铜伴侣蛋白ATOX1负责将Cu转运给高尔基体外侧网络的ATP7A和ATP7B蛋白,进行赖氨酰氧化酶、酪氨酸酶和铜蓝蛋白等铜酶的合成[15]。在小鼠胚胎成纤维细胞中,ATOX1作为铜依赖性转录因子调节因子,有助于细胞增殖[16]。Cu可以通过调节SOD1的表达而维持线粒体过氧化稳态。除此之外,细胞色素氧化酶(COX)利用铜进行氧化磷酸化和稳定线粒体功能[17]。铜ATP酶ATP7A/B是细胞内铜运输的重要载体。在生理条件下,ATP7A/B表达于反式高尔基复合体内,负责将胞浆中的Cu转运到高尔基体管腔内。而当细胞内Cu浓度升高时,ATP7A/B能够转位到细胞膜囊泡上,负责将Cu转运出细胞[18]。

1.3 铜死亡机制研究

关于铜代谢与细胞程序性死亡的研究由来已久。1980年以来,研究表明Cu与细胞程序性死亡有关,但是具体机制未阐明[19]。铜离子载体是一种可逆性结合铜离子的脂溶性分子,在细胞铜死亡中发挥重要作用。铜离子载体可以运输铜离子穿过细胞的质膜或线粒体膜结构[20]。因此,细胞膜或线粒体膜表面铜离子载体表达异常会导致细胞内铜浓度异常而诱导细胞铜死亡。

线粒体发生氧化还原反应时产生的ROS与线粒体代谢和Cu诱导的细胞程序性死亡密切相关[21]。伊利司莫(ES)是公认的铜死亡诱导剂,有研究观察到ES诱导的细胞死亡中线粒体功能紊乱,ROS水平显著升高。ES转运黑色素瘤细胞内Cu并导致线粒体相关蛋白水平降低,从而导致ROS升高而抑制肿瘤细胞增殖。铜离子通过ES转运进入K562细胞后,能够氧化抗坏血酸并与H2O2反应产生更具破坏性的ROS,诱导细胞程序性死亡[22]。由此可见,线粒体功能紊乱产生过量ROS,也是细胞发生铜死亡的重要机制。

Cu可以直接与NPL4相互作用后抑制p97蛋白泛素化蛋白降解,引起p97蛋白聚集或与其直接结合并抑制其构象转变,最终导致细胞程序性死亡[23]。过去研究都将Cu相关的程序性死亡过程认为是细胞凋亡、自噬和铁死亡的中间过程,并通过细胞活力实验、免疫印迹实验、流式细胞术和免疫荧光等实验加以证明。直到2022年3月,TSVETKOV等发现细胞凋亡、坏死、ROS诱导的细胞死亡或铁死亡的抑制剂都不能逆转Cu诱导的细胞死亡,而只有铜螯合剂能实现这一目的,同时胱天蛋白酶-3(Caspase3)的活性没有变化[1]。目前针对铜死亡的研究及其与疾病发生的关系将逐渐成为研究热点。

2 肝脏疾病与铜死亡

无论Cu缺乏还是过量富集都会对机体带来危害[24]。研究表明,门克斯病(Menkes)、威尔逊病(Wilson)、神经退行性疾病、心血管疾病和肿瘤与铜死亡通路密切相关[25]。肝脏是人体腹腔内最大的消化器官,承载着机体消化、代谢、解毒和免疫等重要生理功能。肝脏也是铜吸收和代谢的重要器官,了解铜死亡与肝脏疾病的关系对于阐明铜死亡的机制和肝病的治疗非常重要。

2.1 肝癌与铜死亡

肝癌的发生率和死亡率非常高。铁死亡诱导剂索拉非尼和埃拉斯汀可以通过增加铜依赖性硫酰化蛋白聚集而引起肝癌细胞发生铜死亡[26]。索拉非尼和埃拉斯汀通过抑制线粒体基质相关蛋白酶介导的铁氧还蛋白-1(FDX1)上调蛋白脂质化降解,并通过抑制胱氨酸减少细胞内铜螯合剂谷胱甘肽(GSH)的合成[27]。铁氧还原蛋白1(FDX1)是最重要的铜死亡调节因子。肝癌患者FDX1的表达显著下调,同时FDX1高表达与肝癌患者的生存率明显正相关[28]。临床回顾性分析显示,铜死亡相关基因的表达与患者PD-1/PD-L1免疫检查点分子的表达水平和患者愈后明显正相关。说明铜死亡基因的表达可以作为肝癌免疫治疗评价的生物标志物[29]。

2.2 肝豆状核变性(Wilson)与铜死亡

肝豆状核变性由Wilson在1912年首先描述,故又称为Wilson病(WD)。WD是一种常染色体隐性遗传的铜代谢障碍性疾病,以铜代谢障碍引起的肝硬化、基底节损害为主要临床特征[30]。ATP7B基因突变导致的铜代谢异常是Wilson病重要发病机制。健康者肝内Cu浓度通常低于55 μg/g组织干重;而Wilson病患者肝内Cu浓度高于55 μg/g组织干重[31]。Cu中毒引起的DNA损伤、肝内脂质过氧化和线粒体功能障碍是Wilson病的主要致病机制[32]。线粒体间质变宽、内膜和外膜分离并扩大、出现大液泡等肝脏形态学变化通常发生在WD早期阶段,是WD肝损伤的形态学标志[31]。WD患者的肝脏症状为急性肝功能衰竭、血清转氨酶水平持续升高、黄疸和慢性肝炎。然而,有些患者没有表现出这些肝脏变化,而是出现神经系统症状。肝脏Cu过量积聚可能导致肝硬化的发生[33]。

2.3 非酒精性脂肪性肝病与铜死亡

非酒精性脂肪肝(NAFLD)是世界范围内最常见的肝脏疾病,发病机制仍未阐明。铜死亡作为一种新型细胞程序性死亡模式,与NAFLD之间的关系有待研究。铁氧化还原蛋白-1(FDX1)、硫酰基合酶(LIAS)、脂肪酰转移酶-1(LIPT1)、二氢硫辛酰胺脱氢酶(DLD)、S-乙酰转移酶二氢硫酰胺(DLAT)、丙酮酸脱氢酶E-1α(PDHA1)和丙酮酸脱氢酶E-1β(PDHB)是铜死亡相关基因。临床回顾性分析和NAFLD小鼠模型显示,DLD和PDHB两种基因在NAFLD肝脏病变中显著升高。DLD和PDHB可以作为NAFLD诊断和治疗的生物标志物[34]。血清铜浓度与体重指数(BMI)、瘦素和胰岛素抵抗水平等NAFLD的危险因素明显正相关[35]。肝细胞特异性敲除ATP7基因后,小鼠肝脏铜浓度显著升高,同时导致小鼠肥胖和肝脂肪变性[36]。

2.4 病毒性肝炎与铜死亡

病毒性肝炎是由多种肝炎病毒引起的以肝脏病变为主的一种传染病。中国以乙型肝炎病毒(HBV)感染居多,而西方国家以丙型肝炎(HCV)感染为主。病毒性肝炎如果不加以干预会发展成为肝硬化甚至肝癌[37]。已有研究表明,铁死亡在病毒性肝炎发展为肝纤维化过程中发挥重要功能。乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)通过抑制铁死亡过程而减少HSC细胞死亡[38]。新型冠状病毒(COVID-19)与铜死亡的研究显示:新冠肺炎患者外周血淋巴细胞中铜浓度远高于健康对照组,新冠肺炎患者体内PDHA1和PDHB两种重要的铜死亡基因显著上调[39]。由此可见,虽然目前还没有关于病毒性肝炎与铜死亡的相关研究,但是未来基于细胞铜死亡通路研究HBV或HCV的致病机制及其干预手段具有一定空间。

3 总结与展望

Cu是人体必须的微量元素,然而Cu过量又能导致机体严重的损伤。铜死亡是最新被发现的细胞死亡方式,主要受细胞内线粒体脂酰化酶调节。与细胞铁死亡相似,线粒体ROS和GPX4可以调节细胞铜死亡过程[40]。然而,铜死亡过程未发生线粒体收缩、膜密度增加等形态学变化。鉴于铜死亡过程能够影响细胞铁代谢,未来研究需要关注铜死亡过程中细胞或线粒体的特异性形态学改变,以便于理解两种细胞死亡方式的区别和联系。

门克斯病、威尔逊病、神经退行性疾病、心血管疾病和肿瘤与铜死亡通路密切相关[25]。肝脏铜吸收和代谢的重要器官,了解铜死亡与肝脏疾病的关系对于阐明铜死亡的机制和肝病的干预非常重要。目前铜死亡在肝癌和威尔逊病领域的研究较多,包括机制研究和临床回顾性分析。DLD和PDHB两种铜死亡相关基因在NAFLD肝脏病变中显著升高。病毒性肝炎,尤其是乙型肝炎在中国发病率非常高,肝纤维化是肝炎病毒感染后期最典型的终末期肝病,至今没有有效治疗手段。未来病毒性肝炎和肝纤维化中铜死亡的机制研究将成为热点,并可能对此研发出新的诊断和治疗方法。