木薯MePPD3 基因的克隆及功能分析

贾素行，朱寿松，符仁稳，李春霞，陈银华

（海南大学 热带作物学院，海口 570228）

木薯（Manihot esculenta）是热带地区主要的粮食作物和经济作物，有着“地下粮仓”、“淀粉之王”的称号[1-2]，木薯在我国主要用于各种工业原料的生产[3-5]，其市场前景十分巨大。菜豆黄单胞菌木薯萎蔫致病变种（Xanthomonas phaseolipv.manihotis,Xpm）早已列入我国有害生物名录，它是木薯细菌性枯萎病的病原菌，其能够使木薯叶片褪绿萎蔫甚至全株死亡，可导致木薯减产20%～90%[6-7]。1991 年于类囊体腔中首次发现PsbP 蛋白，后经过不断研究发现PsbP 蛋白广泛存在于藻类、蓝细菌和高等植物中[8-9]。目前，已发现的PsbP 蛋白分为3 大类，分别是PsbP 蛋白、类PsbP 蛋白PPL（PsbP-like protein）和PsbP 结构域蛋白PPD（PsbPdomain protein）[10-12]。PsbP 蛋白是叶绿体光系统Ⅱ（photosystem Ⅱ complex, PSⅡ）的重要组成部分，它在维持钙离子、氯离子浓度方面发挥重要作用；此外，敲除PsbP基因后， PSⅡ的功能将受到一定的影响[13-15]。科学家在拟南芥（Arabidopsis thaliana）中发现，PPL1 能参与 PSⅡ复合体的组装，其和植物适合光照强度变化有关[16-17]；拟南芥的PPL2 缺失突变体中，叶绿体NADH 脱氢酶的积累量和活性降低[17]。Roose 等[8]于2007 年从拟南芥基因组中鉴定出7 个PPD 蛋白，它们分别是PPD1、PPD2、PPD3、PPD4、PPD5、PPD6、PPD7。已有研究发现，PPD1 是PSI 复合体的组装因子，在拟南芥中，PPD1 缺失突变体能导致PSI 复合体无法正常组装，从而影响植物的光合作用[18-19]；在拟南芥中，PPD5 蛋白和OST1 相互作用并被其磷酸化，使细胞中H2O2积累增加并使气孔关闭增强[20]。但目前尚未有过任何关于PPD3 蛋白功能的研究报道。

本研究以‘华南8 号’木薯为材料，通过qRTPCR 扩增得到MePPD3（Manihot esculenta psbP domain-containing protein 3）基因，并对该基因进行生物信息学分析；同时，对该基因在木薯不同部位和病原菌XpmCHN11 侵染后不同时间的表达模式进行分析；最后利用TRV 介导的基因沉默技术沉默MePPD3基因后测定抗病表型，旨在为进一步研究MePPD3基因的分子机理和木薯抗细菌枯萎病的抗病机理提供基础。

1 材料与方法

1.1 菌株大肠杆菌DH5α 感受态细胞和农杆菌GV3101 感受态细胞购自上海唯地生物；菜豆黄单胞菌木薯萎蔫致病变种Xanthomonas phaseolipv.manihotisCHN11 由笔者所在实验室提供。

1.2 植物材料供试的木薯品种为‘华南8 号’（‘SC8’），由笔者所在实验室提供。

1.3 试剂多糖多酚植物总RNA 提取试剂盒（RNA prep Pure Plant Kit）和RNA 反转录试剂盒（FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix）购自天根生化科技有限公司；琼脂糖凝胶回收试剂盒和质粒小提试剂盒购自艾德莱。

1.4 所用引物从phytozome 数据库中下载木薯MePPD3基因的CDS 序列，使用Primer Primer 5.0 分别设计该基因的全长扩增引物、定量分析引物和亚细胞定位引物。本研究所用引物如表1所示。

表1 本研究所用引物

1.5 MePPD3基因cDNA 全长序列克隆取少许木薯叶片于液氮中速冻，用液氮预冷后的研钵进行研磨。使用试剂盒提取木薯RNA 并将其反转录为cDNA。以木薯cDNA 为PCR 模板，以MePPD3-F 和MePPD3-R 为引物，扩增木薯Me-PPD3基因序列。待琼脂糖凝胶电泳检测结果无误后，转入植物亚细胞载体pCAMBIA1300-35SGFP 中，挑选阳性单克隆送至楠山生物进行测序。

1.6 MePPD3基因的生物信息学分析借助SignalP 5.0 Server 对MePPD3 蛋白的信号肽进行预测；通过TMHMM Serverv 2.0 分析MePPD3 蛋白的跨膜结构；利用NetPhos 3.1 Server 在线工具（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）预测Me-PPD3 蛋白的磷酸化位点和糖基化位点；分别使用在线网站PSIPRED.（http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/）和PHYRE2（http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/～phyre2/html/page.cgi?id=index）预测MePPD3 蛋白的二级结构和三级结构。

通过NCBI 序列比对，找到MePPD3 蛋白在不同植物中的同源蛋白。通过DNAMAN 8.0 软件对这9 个同源蛋白进行多序列比对；使用MEGA 11.0 软件对这些同源蛋白构建NJ 进化树；使用MEME 在线网站对MePPD3 及其同源蛋白进行保守Motif 分析。

1.7 MePPD3基因的亚细胞定位将构建好的植物亚细胞定位载体pCAMBIA1300-35S-GFPMePPD3与空载pCAMBIA1300-35S-GFP 分别转入GV3101 菌株。挑取阳性克隆于28 ℃ 200 r·min-1培养过夜，取适量菌液转移至新的LB（含Kan 和Rif）液体培养基中扩大培养。调节OD600≈1.0，黑暗静置2.5 h，注射于生长30 d 左右的烟草（Nicotiana tabacum）叶片背面，做好标记，培养40 h 后于共聚焦显微镜下观察其荧光。

1.8 qRT-PCR 检测MePPD3基因在木薯不同部位中的表达水平使用Primer Primer 5.0 设计定量引物qpcr-MePPD3-F/R。分别取长势相同的木薯的顶芽、幼嫩叶片、成熟叶片、叶柄、须根、块根等部位，每个部位至少3 个生物学重复，液氮速冻后，使用RNA prep Pure Plant Kit 试剂盒提取木薯总RNA，然后再按照FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix 试剂盒的流程反转录cDNA。

1.9 qRT-PCR 检测XpmCHN11 侵染后不同时间MePPD3基因表达水平变化用OD600≈0.05的菜豆黄单胞菌木薯萎蔫致病变种XpmCHN11侵染多株长势相同的木薯，分别于侵染后0 h、6 h、1 d、3 d、5 d 随机剪取叶片，液氮速冻后将其研磨提取RNA，并反转录为cDNA。

1.10 VIGS 沉默MePPD3基因后检测木薯抗病性有无变化构建沉默载体pCsCMV-MePPD3。将其与正对照pCsCMV-B 和负对照pCsCMVA 分别转化入GV3101 菌株，在LB 液体培养基（含Kan 和Rif）中培养阳性克隆至OD600=1.0。然后注射于木薯‘SC8’叶片背面，24 ℃培养30 d。

在LPGA 固体培养基（含Chl）上活化XpmCHN11 菌株，活化2 次后，用无菌水清洗菌体并稀释至OD600=0.05，用该菌液注射木薯叶片。侵染6 d 后，观察叶片表面病斑的扩散情况。

2 结果与分析

2.1 MePPD3基因的克隆及其理化性质分析以木薯RNA 为模板，MePPD3-F/R 为上下游引物，通过RT-PCR 技术，得到目的基因MePPD3（Manihot esculenta psbP domain-containing protein 3）（图1-a）。基因序列分析发现，MePPD3基因全长807 bp，编码268 个氨基酸。ExPasy 在线网站分析结果显示，MePPD3 相对分子质量为67 522.75，理论等电点为5.11，分子式为C2 467H4 129N807O1 033S184，不稳定系数为49.9，脂肪系数为27.14，亲水系数为0.775。使用NCBI 的CDD 数据库分析其保守结构域，结果发现，其氨基酸序列第106～266 位存在PsbP 结构域（图1-b），推测其为PPD3蛋白。

图1 MePPD3 基因全长扩增及蛋白结构分析

2.2 MePPD3 蛋白的生物信息学分析使用NetPhos 在线网站，预测MePPD3 蛋白有32 个磷酸化位点，其中，有19 个丝氨酸、6 个苏氨酸和7 个酪氨酸（图2-a）；有5 个糖基化位点（图2-b）；使用TMHMM 在线网站预测发现，其存在跨膜结构域（图2-c）；使用SignalIP 在线网站发现，其无信号肽（图2-d）；使用PSIPRED 在线网站预测MePPD3 蛋白二级结构，发现其有6 处螺旋结构，其中，螺旋占21.3%，折叠占26.5%，无规卷曲占52.2%（图2-e）；通过PHYRE2 在线网站预测其三级结构，发现其有6 个螺旋结构，这符合二级结构预测结果和PsbP 蛋白的结构特征（图2-f）。

图2 MePPD3 蛋白的生物信息学分析

2.3 MePPD3 蛋白同源序列、进化树和保守结构域分析为研究PPD3 蛋白在不同植物中是否具有较高的同源性，首先在NCBI 通过BLAST 比对，在橡胶（Hevea brasiliensis）、蓖麻（Ricinus communis）、雷公藤（Tripterygium wilfordii）、茶树（Camellia sinensis）、胡杨（Populus euphratica）、芒果（Mangifera indica）、麻风树（Jatropha curcas）、开心果（Pistacia vera）等8 种植物中找到了与木薯MePPD3 蛋白同源的氨基酸序列（表2）。使用DANMAN 8.0 对这些序列进行比对（图3），结果发现，MePPD3 蛋白在不同的植物中具有较高的同源性，其中与橡胶中PPD3 蛋白的同源性最高。PsbP 保守结构域在不同植物中的差别不大（图中红线框），且N 端氨基酸序列含有叶绿体/线粒体定位信号（图中蓝线），表明MePPD3 蛋白可能定位于叶绿体或线粒体。

图3 MePPD3 在不同植物中的同源序列比对

表2 MePPD3 在不同植物中的同源蛋白

为了进一步验证这些蛋白的亲缘关系，使用MEGA11.0 对这9 个同源蛋白构建NJ 进化树（图4）。结果发现，木薯中的MePPD3 蛋白与其他几种植物中的MePPD3 蛋白具有较高的亲缘关系，值得一提的是它与橡胶中PPD3 蛋白的亲缘关系最接近，可达99%，蓖麻中的PPD3 蛋白次之。

图4 不同物种间MePPD3 同源蛋白的系统进化树分析

应用MEME 在线网站对MePPD3 蛋白及其同源蛋白进行保守Motif 分析（图5），发现这9 个同源蛋白至少含有6 个保守Motif，其中，Motif 1、Motif 2、Motif 3、Motif 4 和Motif 6 具有高度保守性。此外，MePPD3 蛋白和橡胶、蓖麻中PPD3 蛋白具有Motif 的种类和数量一致，均具有这8 个Motif。这与同源蛋白多序列比对和进化树分析的结果一致，初步说明，PPD3 蛋白在不同植物体内具有较高的保守性，MePPD3 蛋白的功能极有可能与其他PPD3 蛋白的功能一致。

图5 MePPD3 结构域分析

2.4 MePPD3 蛋白的亚细胞定位为探究木薯MePPD3 蛋白在植物细胞内的亚细胞定位，构建了植物亚细胞定位载体pCAMBIA1300-35S-GFPMePPD3（图6-a）。使用已提前转进GV3101 菌株的亚细胞定位载体pCAMBIA1300-35S-GFPMePPD3和空载pCAMBIA1300-35S-GFP 注射生长约30 d 的烟草叶片。40 h 后，剪取叶片观察荧光信号（图6-b），结果发现，与对照（GFP 空载）相比，试验组在叶绿体中能观测到绿色荧光，且能与叶绿体的红色自发荧光基本重合，表现出黄色的光。说明MePPD3 蛋白定位在叶绿体中，符合Psbp 蛋白（叶绿体光系统II 亚基蛋白）的特点。

图6 MePPD3 蛋白的亚细胞定位

2.5 木薯不同部位MePPD3基因的表达模式分析为研究木薯MePPD3基因在木薯不同部位中的表达情况，分别选择同一株‘SC8’木薯的成熟叶片、幼嫩叶片、叶柄、顶芽、块根、须根等部位，对其进行real-time PCR 检测MePPD3基因的表达量是否发生变化。观察发现（图7），MePPD3基因在木薯不同组织中均有表达，其在木薯叶片中的表达量最高，在幼嫩叶片中的表达量为顶芽的5 倍，在成熟叶片中的表达量为顶芽的18 倍；在木薯的叶柄、须根、块根的表达量和顶芽接近。这说明MePPD3基因主要在木薯的叶片中表达，这与其具有的Psbp 结构域的功能相符。

图7 MePPD3 基因在木薯不同部位的表达模式图

2.6 病原菌侵染不同时间后MePPD3基因的表达模式分析为探究病原菌XpmCHN11 侵染后MePPD3基因在木薯叶片中的表达量是否发生变化，分别取接种0、6 h，1 、3 、5 d 的木薯叶片，通过实时荧光定量PCR 检测MePPD3基因的表达量变化（图8）。从中可以明显地看出，在XpmCHN11 侵染木薯后的不同时间，MePPD3基因的表达量呈先上升再下降趋势。在6 h 时，其表达量上升了2.5 倍；在1 、3 和5 d 时，其表达量逐渐下降为本底表达量。这说明，MePPD3基因可能在木薯抗病过程中发挥着作用。

图8 病原菌侵染后不同时间MePPD3 基因的表达量

2.7 MePPD3基因沉默后木薯SC8 抗病性为明确MePPD3基因在木薯抗病过程中的作用，采用VIGS 技术沉默MePPD3基因，沉默40 d后，接种正对照植株的叶片出现了白化表型（图9-a）。qRT-PCR 结果显示，经过VIGS 沉默之后，MePPD3基因的相对表达量显著降低，其表达量下降了2 倍（图9-b），说明该基因受到了有效沉默。

图9 VIGS 沉默植株表型及抗病性检测

分别在沉默植株和野生型植株上接种XpmCHN11，结果发现，接种后6 d，沉默植株和野生型植株叶片均已产生水渍状病斑，且沉默植株的水渍状病斑明显小于野生型植株（图9-c），统计后发现沉默植株的病斑面积约为对照植株的一半（图9-d），该结果显示MePPD3负调控了木薯的抗病性。

3 讨 论

叶绿体是植物体所特有的细胞器，它能为植物体的各项生命活动提供能量。PsbP 蛋白是叶绿体光系统Ⅱ的重要组成部分，它能参与 PSⅡ的组装[13-15]。此外，葡萄球菌萄球菌RXLR 效应因子RXLR31154 通过影响Psbp 来降低H2O2积累，从而促进葡萄致病[21]。PPD 蛋白是PsbP 蛋白家族的一员，目前已发现的PPD 蛋白有7 种。蛋白在PSI 组装过程中发挥重要作用[18-19]；PPD5 蛋白和ROS 爆发、气孔关闭有关[19]。以上研究充分说明了Psbp 蛋白在植物光合作用和免疫反应中发挥着一定的作用。但目前关于PPD3 蛋白的研究却不是很多。

为了增进对PPD3 蛋白的了解，本研究首次从木薯数据库中得到MePPD3基因。MePPD3基因CDS 序列全长807 bp，编码268 个氨基酸序列。对MePPD3基因进行了一系列的生物信息学分析，结果发现：该蛋白第50～100 位存在跨膜结构，第106 到266 位为PsbP 保守结构域。其三级结构由6 个螺旋组成，符合PsbP 蛋白家族的结构特征。选取8 种植物中的同源蛋白序列进行多序列比对、进化树和保守结构域分析，结果发现，PPD3 蛋白在不同植物中具有较高的保守性，木薯MePPD3 蛋白和橡胶中PPD3 蛋白具有相同的保守结构域，且两者的相似性可达99%。因此，推测PPD3 蛋白在不同植物中起到的作用一致或相近。此外，通过烟草瞬时表达，证实MePPD3 定位于叶绿体，这与PPD3 蛋白的叶绿体/线粒体定位信号相符，说明MePPD3 可能在叶绿体中发挥功能。另外，本研究通过qRT-PCR 检测，发现MePPD3基因在木薯成熟叶片中表达量最高；黄单胞菌XpmCHN11 侵染木薯叶片后，MePPD3表达量呈现上调趋势，初步推断，MePPD3可能参与了木薯的抗病途径；VIGS 沉默MePPD3基因后接种结果显示，MePPD3负调控木薯的抗病途径。结合前人研究推测，MePPD3 可能通过影响气孔开闭和ROS 爆发来参与木薯抗病，是否正确仍需要后续研究来证实。