成年食蟹猴视网膜结构和功能参数

廖科人 彭斌 郑红梅 刘一帆 沈吟,2

1武汉大学人民医院眼科中心,武汉 430060;2武汉大学医学研究院,武汉 430071

食蟹猴为非人灵长类动物,其生物学特性与人类相近,是研究人类疾病的最佳动物模型之一,常用于临床前试验研究。食蟹猴的眼球大小、结构与人类眼球相近,视网膜有黄斑中心凹,还具有立体视觉、色觉等视觉生理功能,是理想的眼科实验动物模型。食蟹猴常应用于眼科的药物研究领域、眼科细胞或基因治疗的疗效与安全性观察[1-2];其在青光眼、糖尿病、黄斑变性等视网膜疾病的研究中发挥了重要作用[3-4]。食蟹猴价格昂贵,动物伦理也要求尽量减少其使用。因此,本研究通过规范化的流程对成年食蟹猴视网膜进行光学相干断层扫描(optical coherence tomography,OCT)和视网膜电图(electroretinogram,ERG)等测量,并探讨其与正常人视网膜的结构和功能参数的相似度,以期为新药临床前研究和毒理药理安全评价中心的食蟹猴视网膜相关研究提供参考数据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物 成年雄性食蟹猴3只购自广州相观生物科技有限公司(动物合格证号:448183000000899),5岁,体质量4～5 kg,无全身及眼部疾患。动物均单独饲养于湖北天勤生物科技有限公司武汉分公司动物房[SYXK(鄂)2016-0090)],在60 cm×68 cm×75 cm的铁笼中,并置于室温22～24 ℃、相对湿度50%～60%、12 h明-暗光交替光照环境中。本研究中对动物的实验操作均遵守实验动物福利伦理,研究方案经湖北天勤生物科技有限公司实验动物福利伦理委员会批准(批文号:IACUC准-2019-012)。

1.1.2主要试剂及仪器 舒眠宁[5](替来他明、赛拉嗪和咪达唑仑混合制剂,南京农业大学小动物疾病研究室研制);复方托吡卡胺滴眼液(沈阳兴齐眼药股份有限公司);玻璃酸钠滴眼液(日本参天制药株式会社);盐酸丙美卡因滴眼液[爱尔康(中国)眼科产品有限公司];盐酸左氧氟沙星眼用凝胶(湖北远大天明制药有限公司)。Horus手持式眼底照相机(DEC100,中国台湾晋弘科技有限公司);OCT仪(iVUE-100,美国OPTOVUE公司);RETeval手持式电生理仪器(美国LKC公司);Jet角膜接触电极(ERG-jet,瑞士Fabrinal公司)。

1.2 方法

1.2.1麻醉方法 本实验均在动物操作全身麻醉状态下进行,检测前12 h禁食,麻醉前称体重,并按照0.5 ml/kg的剂量肌肉注射舒眠宁进行全身麻醉;麻醉后使其仰卧,将舌拉出口腔防止窒息。实验操作过程中若出现眼睑活动、肌肉紧张等麻醉变浅状态,立即按之前麻醉剂量的1/3追加麻醉1次。

1.2.2眼底照相 麻醉前将动物固定于猴椅,复方托吡卡胺滴眼液充分扩瞳。行全身麻醉后将其呈仰卧位置于检测台,开睑器撑开眼睑后,使用Horus手持式眼底照相机于暗室中对其双眼进行眼底拍摄。检测过程中使用玻璃酸钠滴眼液点眼预防角膜干燥。

1.2.3光谱域OCT 常规扩瞳后麻醉动物,使其处于俯卧位,使用OCT仪对双眼进行扫描,扫描区域包括黄斑区和视盘,扫描速度为26 000次/s,轴向分辨率为5 μm,扫描深度为2 mm,扫描区域面积为6 mm×6 mm。由同一位经验丰富的检查者完成扫描,至少重复测量2次。检测过程中使用玻璃酸钠滴眼液点眼预防角膜干燥,同时在眼表形成光滑且利于成像的光学表面。利用仪器自动检测系统检测黄斑中心凹及距中心凹1 000和2 000 μm处鼻侧、颞侧、上方、下方的视网膜全层及内、外层视网膜厚度。各视盘参数使用视盘分析模式扫描并计算,视盘参数包括盘缘面积、视盘面积、视杯体积、杯/盘面积比、杯/盘垂直比、杯/盘水平比。视网膜神经纤维层(retinal nerve fiber layer,RNFL)厚度参数包括总体、上方、下方平均RNFL厚度以及视盘周围:颞侧上方(temporal upper,TU)、颞侧下方(temporal lower,TL)、上方颞侧(superior temporal,ST)、上方鼻侧(superior nasal,SN)、鼻侧上方(nasal upper,NU)、鼻侧下方(nasal lower,NL)、下方鼻侧(inferior nasal,IN)、下方颞侧(inferior temporal,IT)8个区域的平均RNFL厚度。

1.2.4闪光ERG 应用RETeval手持式电生理仪记录动物的闪光ERG。常规扩瞳,并置于暗室中暗适应至少40 min;行全身麻醉后取仰卧位置于检测台上,用开睑器撑开动物眼睑,盐酸丙美卡因滴眼液进行表面麻醉,于暗红光条件下安放电极,其中,角膜接触镜电极内涂盐酸左氧氟沙星眼用凝胶后放置在动物角膜上,参考电极和接地电极涂上导电膏后分别置于外眦部和前额。按照ISCEV标准[6]顺序记录暗适应0.01 ERG、暗适应3.0 ERG、暗适应3.0振荡电位(oscillatory potentials,OPs)和暗适应10.0 ERG各波的振幅与峰时。待暗适应ERG记录完成后,进行5 min的明适应(30 cd·s/m2),记录明适应3.0 ERG和明适应30 Hz闪烁ERG各波的振幅和峰时。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 成年食蟹猴正常眼底图像

成年食蟹猴正常眼底图像与人类相似,视盘呈椭圆形,浅红色,边界清楚,中央有生理性凹陷,色泽稍淡,左右眼对称;视网膜中央动脉颜色鲜红,静脉颜色暗红,视网膜透明,可见下方的色素上皮及脉络膜;黄斑部位于视盘颞侧偏下方,此区域无血管,中心有一星样反光点,黄斑周围还可见一反光轮(图1A,B)。

图1 正常成年食蟹猴彩色眼底照相和视网膜OCT图像 A:右眼彩色眼底照相 B:左眼彩色眼底照相 C:视盘OCT图像 D:黄斑中心凹OCT图像

2.2 成年食蟹猴正常的视网膜、视盘及RNFL参数

成年食蟹猴视网膜的黄斑中心凹处和视盘处的OCT图像显示,黄斑中心凹形态可见,视网膜各层结构层次清晰(图1C,D)。食蟹猴黄斑中心凹处视网膜总厚度为(252.31±4.79)μm。黄斑中心凹周围4个象限鼻侧视网膜最厚,距中心凹2 000 μm处为(340.85±3.77)μm。视网膜平均RNFL厚度为(103.53±0.58)μm。左右眼间视网膜各层及各象限厚度比较,差异均无统计学意义(均P>0.05)(表1)。

正常成年食蟹猴视盘面积为(1.89±0.05)mm2,杯盘面积比为0.14±0.01。不同眼别间盘沿面积、视盘面积、视杯面积、杯盘面积比、杯盘垂直比、杯盘水平比比较,差异均无统计学意义(均P>0.05)(表2)。在视盘周围8个RNFL区域中,以ST和IT最厚,而鼻侧(NU+NL)和颞侧(TU+TL)较薄。不同眼别间各部位RNFL厚度比较,差异均无统计学意义(均P>0.05)(图2)。

图2 正常成年食蟹猴各区域RNFL厚度比较 左右眼间各区域RNFL厚度比较,差异均无统计学意义(配对样本t检验) RNFL:视网膜神经纤维层;NU:鼻侧上方;IN:下方鼻侧;NL:鼻侧下方;IT:下方颞侧;TL:颞侧下方;TU:颞侧上方;ST:上方颞侧;SN:上方鼻侧

2.3 成年食蟹猴正常ERG表现

成年食蟹猴暗适应0.01 ERG波形表现为缓慢上升的正向b波,a波不明显,而在暗适应3.0 ERG和暗适应10.0 ERG中波形由开始向下的负向a波和随后向上的正向b波组成,且b波的上升支存在不明显的节律性振荡。暗适应3.0 OPs由4～5个波形为一组的节律性波形组成。成年食蟹猴明适应3.0 ERG波形也为a、b波的组合,明适应3.0闪光ERG则为一组类似正弦波的周期性变化波形(图3)。正常成年食蟹猴ERG暗适应0.01 ERG b波振幅为(66.75±7.29)μV,暗适应3.0 ERG a、b波振幅分别为(57.15±15.01)、(122.10±25.51)μV,暗适应10.0 ERG a、b波振幅分别为(72.98±20.14)、(131.67±13.78)μV,OPs振幅为(49.98±10.08)μV,峰时为(30.02±5.76)ms,明适应3.0 ERG a、b波振幅分别为(9.16±2.75)、(40.43±5.57)μV,明适应闪烁光反应峰时为(26.61±1.19)ms,振幅为(24.72±5.10)μV。正常成年食蟹猴不同眼别间ERG各参数的振幅和峰时比较,差异均无统计学意义(均P>0.05)(表3)。

表1 正常成年食蟹猴不同眼别各区域视网膜厚度比较(x±s,μm)Table 1 Comparison of retinal thickness in different regions of normal adult Macaca fascicularis between both eyes (x±s,μm)眼别样本量不同区域全视网膜厚度 中心凹鼻侧距中心凹1 000 μm鼻侧距中心凹2 000 μm颞侧距中心凹1 000 μm颞侧距中心凹2 000 μm上方距中心凹1 000 μm上方距中心凹2 000 μm下方距中心凹1 000 μm下方距中心凹2 000 μm右眼3254.83±7.12334.17±6.50348.50±4.55320.67±7.93309.83±7.11329.00±9.29323.50±6.91328.50±7.19326.00±4.50左眼3250.14±6.89330.14±2.81334.29±4.75313.00±5.99292.71±8.00321.57±4.39309.57±4.70314.43±3.38312.43±4.95t值0.4730.5692.1600.7721.6000.7231.6671.7712.028P值0.6610.6000.0970.4830.1850.5100.1710.1510.112眼别样本量不同区域内层视网膜厚度中心凹鼻侧距中心凹1 000 μm鼻侧距中心凹2 000 μm颞侧距中心凹1 000 μm颞侧距中心凹2 000 μm上方距中心凹1 000 μm上方距中心凹2 000 μm下方距中心凹1 000 μm下方距中心凹2 000 μm右眼345.00±2.21117.40±1.72122.60±1.29114.60±1.75109.04±0.68116.20±2.37113.20±1.91120.80±0.86115.40±0.98左眼342.14±1.74115.29±1.73121.71±1.66111.00±1.02107.86±1.37117.71±2.54113.00±1.95117.71±1.27109.86±2.91t值1.0170.8650.4230.1780.7720.4350.0732.0151.804P值0.3670.4360.6940.1500.4840.6860.9450.1140.146眼别样本量不同区域外层视网膜厚度 中心凹鼻侧距中心凹1 000 μm鼻侧距中心凹2 000 μm颞侧距中心凹1 000 μm颞侧距中心凹2 000 μm上方距中心凹1 000 μm上方距中心凹2 000 μm下方距中心凹1 000 μm下方距中心凹2 000 μm右眼3210.00±8.07219.60±7.19226.80±4.65207.60±8.48195.60±6.85217.60±10.85209.20±10.08210.00±8.73212.20±5.09左眼3207.86±5.88214.86±3.46212.71±5.15201.86±5.83185.00±7.61203.86±4.22196.57±4.61203.00±2.91202.57±4.95t值0.2140.5940.2030.5581.0351.1801.1390.7611.356P值0.8410.5840.1120.6070.3590.3030.3180.4890.246 注:(配对样本t检验) Note:(Paired samples t-test)

表2 正常成年食蟹猴不同眼别视盘相关参数测量值比较(x±s)Table 2 Comparison of optic disk parameters of normal adult Macaca fascicularis between both eyes (x±s)眼别样本量盘沿面积(mm2)视盘面积(mm2)视杯体积(mm3)杯盘面积比杯盘垂直比杯盘水平比右眼31.56±0.071.79±0.090.010±0.0020.13±0.010.30±0.020.38±0.03左眼31.66±0.081.97±0.060.010±0.0040.16±0.020.28±0.020.47±0.04t值0.9410.166<0.0011.3420.7071.800P值0.4000.171>1.0000.2510.5180.146 注:(配对样本t检验) Note:(Paired samples t-test)

图3 正常成年食蟹猴ERG各反应波形 A:暗适应0.01 ERG B:暗适应3.0 ERG C:暗适应10.0 ERG D:暗适应3.0 OPs E:明适应3.0 ERG F:明适应3.0闪光ERG 1号波和2号波为同一眼的2次重复

2.4 食蟹猴与人类和兔视网膜结构和ERG比较

本研究实测结果与既往文献研究结果比较,食蟹猴视网膜结构参数和ERG与人相近,但与兔差别较大(表4)。

表4 食蟹猴与人类、兔视网膜结构和ERG测量值对比Table 4 Comparison of structural parameters and ERG measruements of retina among Macaca fascicularis,human and rabbit参数食蟹猴人兔中心凹视网膜厚度(μm)252.31±4.79248.9±12.9[7]/RNFL厚度(μm)103.53±0.58103.2±12.6[8]109.6±23.8[9]视盘面积(mm2)1.89±0.052.01±0.32[10]6.41±1.23[11]盘沿面积(mm2)1.61±0.061.40±0.19[10]1.37±0.90[11]暗适应3.0 ERG a波振幅(μV)57.15±15.0158.7(35.4-85.4)[12]∗10.07±8.35[13]暗适应3.0 ERG b波振幅(μV)122.10±25.5187.6(54.5-132.5)[12]∗172.80±36.86[13]明适应3.0 ERG a波振幅(μV)9.16±2.757.9(4.8-11.9)[12]∗20.66±17.12[13]明适应3.0 ERG b波振幅(μV)40.43±5.5733.5(21.8-54.5)[12]∗124.2±11.1[13] 注:计量资料以x±s表示,n≥3;∗:该计量资料以M(P5-P95)表示 ERG:视网膜电图;RNFL:视网膜神经纤维层 Note:Data were expressed as the x±s of measurement,n≥3;∗:this data was expressed as the M(P5-P95) ERG:electroretinogram;RNFL:retinal nerve fi-ber layer

3 讨论

食蟹猴的生理特征、生化指标、眼的结构和功能与人类相似,常用于视网膜疾病治疗药物的安全性或有效性评估。本研究对正常成年食蟹猴的视网膜结构和功能进行了观察和检测,提供了彩色眼底照相、OCT、ERG等视网膜相关研究指标的实测结果,为食蟹猴在视网膜相关的研究应用提供了参考和理论基础。

食蟹猴视网膜拥有黄斑区和中心凹结构,较小鼠、大鼠和兔等常用实验动物更接近人视网膜,视网膜血管形态和分布也与人类最为接近,更适合作为人类药物研究的眼底疾病模型和药物的视网膜安全性研究[14-16]。本研究应用OPTOUVE iVUE-100 OCT测定食蟹猴中心凹区视网膜厚度为(252.31±4.79)μm,对比Mitkova-Hristova等[7]使用同一仪器测量84名健康人的平均黄斑中心凹区视网膜厚度(248.9±12.9)μm相近。同时本研究结果显示,食蟹猴和人类均为鼻侧视网膜最厚,说明猴和人一样存在视盘至黄斑区域密集的神经纤维[17]。

本研究测量的食蟹猴平均RNFL厚度为(103.53±0.58)μm,与Wang等[8]采用OPTOUVE iVUE-100测得的北京地区1 654名健康人的平均RNFL厚度(103.2±12.6)μm接近,与Choi等[18]测量11只食蟹猴的平均RNFL厚度(100.20±5.89)μm也基本一致。此外,各区域RNFL厚度与Niklaus等[19]的测量值相近。本研究对成年食蟹猴各区域RNFL的厚度检测发现,颞上和颞下象限的RNFL最厚,而鼻侧和颞侧较薄,这与已报道的人RNFL厚度的“双驼峰”形态一致[20]。RNFL主要由神经节细胞轴突组成,节细胞轴突以一定排列方式走向视盘,视盘和颞侧的上下方均有节细胞轴突走行,黄斑颞侧的轴突经黄斑上下弓形区分别进入视盘的颞侧,黄斑鼻侧的轴突则直接进入视盘鼻侧,因此,视盘上下方含有较多的神经纤维,尤其是颞上和颞下象限。

ERG是评估视网膜功能的重要手段[21],暗适应ERG主要反映视杆系统的功能,明适应ERG则主要反映视锥系统的功能。a波主要是由视网膜光感受器的对光活动形成,b波则主要反映视网膜内核层的电活动[22]。本研究所记录的食蟹猴ERG波形与正常成人的ERG波形更相似[23]。而与小鼠ERG[24]相比,食蟹猴视杆反应较低,而视锥反应较高,可能与鼠科动物夜间活动的生活习性有关,以夜视为主。本研究中手持ERG测量的食蟹猴OPs振幅为(49.98±10.08)μV,Asakawa等[12]使用同一仪器测量的人类OPs振幅为49.0(47.3～50.6)μV,研究结果相近。本研究结果显示,食蟹猴ERG测量值更接近人类,尤其是视锥系统即黄斑中心的视网膜功能。刘闻一等[25]对比了猕猴与人的闪光ERG检测结果,发现猕猴明适应3.0 ERG和明适应30 Hz ERG OPs的波形和振幅与人相近,进一步说明了非灵长类动物的ERG数据可在同等条件下借鉴人的参考值。

本研究测量的食蟹猴左、右眼中心凹区视网膜厚度、平均RNFL厚度、ERG的波形与振幅等结果比较差异均无统计学意义,因此,涉及这些检测指标的实验研究可采用食蟹猴单眼作为实验组,对侧眼作为对照组,以减少样本量少的情况下个体差异对研究结果造成的影响。如前所述,本研究测量的食蟹猴中心凹区视网膜厚度、平均RNFL厚度、OPs振幅等数据与使用相同仪器测量的健康人群数据相近。但使用RETIcom测得的食蟹猴OPs振幅为(32.34±11.62)μV,使用Heidelberg Engineering GmbH OCT测得食蟹猴中心凹区视网膜厚度的结果为(286.27±18.43)μm[18],与本研究测量结果不一致,可能是测量仪器不同导致的。由于相同仪器测得食蟹猴视网膜形态和功能参数与健康人群的数值非常接近,考虑到食蟹猴价格昂贵、伦理受限、数量有限,在体研究中相同仪器所检测的健康人群数据具有一定的参考价值。

本研究实测结果与既往文献研究结果进行比较结果显示,食蟹猴视网膜参数与人视网膜相近。虽然食蟹猴纳入的样本数量有限,但本研究结果显示各食蟹猴个体之间的差异非常小,且测量结果与人的研究报道非常相近,说明采用非人灵长类视网膜的药物研究有重要参考价值,可以节省大量动物的使用。本研究侧重于对成年食蟹猴视网膜结构和功能参数的测量,而未对角膜及其他眼科参数进行测量。已有研究表明,非人灵长类动物的角膜水平和垂直直径、中央角膜厚度、眼轴长度等测量值与人类有差异,但在角膜垂直和水平直径的比率、角膜曲率半径和眼轴长度的变化规律方面与人类相近[26-27]。

本研究为正常成年食蟹猴视网膜厚度、RNFL厚度、视盘参数和视觉电生理等视网膜生物学参数提供参考数据,并发现这些数据与正常人群视网膜实测值非常相近,证明食蟹猴是临床前研究眼底疾病的理想实验动物。应用食蟹猴的实验研究可以参考健康人群的视网膜结构和功能参数。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

作者贡献声明廖科人:直接参与实验和撰写文章;彭斌、郑红梅、刘一帆:辅助分析;沈吟:酝酿、设计实验和文章修改