电针对薄型子宫内膜模型大鼠蜕膜巨噬细胞M1/M2极化水平调节的效应研究＊

杨 滨，潘 妍，金纯纯，沈真如，席 瑾，程 洁，夏有兵，2＊＊

（1.南京中医药大学针灸推拿·养生康复学院 南京 210046；2.徐州医科大学 徐州 221046）

妊娠期女性于排卵日子宫内膜厚度小于7 mm 可被定义为薄型子宫内膜[1-2]。薄型子宫内膜很大程度上影响胚胎着床的成功率，进而降低孕龄女性的妊娠率。研究表明，在接受辅助生殖技术的患者中，薄型子宫内膜的发生率约为5%[3]。甚至有的生殖中心会在子宫内膜厚度小于7 mm时建议取消移植[4]。

薄型子宫内膜严重影响子宫内膜蜕膜化的水平。子宫内膜蜕膜化是间质细胞、腺体、免疫细胞等为胚胎着床而进行的一系列生理变化，是胚胎成功着床的必要条件[5]。在蜕膜化过程中子宫内膜间质细胞以及卵巢颗粒细胞分泌大量IGFBP-1 并促进子宫内膜间质细胞有丝分裂[6-7]。因此IGFBP-1 被认作是蜕膜化的标志物。在上述生理变化中，免疫细胞的调节显得尤为重要[8]，其中高表达小鼠含生长因子样模体粘液样激素样受体（Mouse EGF-like module-containing mucin-like hormone receptor-like 1，EMR1 又称F4/80）与分化簇11b（Cluster of differentiation 11b，CD11b）标志物的巨噬细胞为免疫细胞中的第二大群体，发挥着不可替代的作用[9]。巨噬细胞根据其表型和功能可以分为经典激活（M1）和交替激活（M2）两种亚型[10]。M1型巨噬细胞以高水平表达CD86 为主，过多的M1 型巨噬细胞能导致一系列不良的妊娠结局；而M2 型巨噬细胞则以表达CD206 为主，过多的M2 型巨噬细胞能促进蜕膜化的进行，有助于妊娠过程顺利的进行[11-12]。电针疗法已经成为辅助生殖领域中重要的一种治疗手段[13]，与此同时电针疗法也能有效地调节各个组织中巨噬细胞的极化水平，如肺泡组织[14]、关节滑囊[15]、气管[16]、白色脂肪组织[17]等。虽然上述因素之间都有一定的相关性，但鲜有研究探索电针、薄型子宫内膜和蜕膜巨噬细胞极化三者之间的关系。本研究通过电针薄型子宫内膜模型大鼠的“关元”、“子宫”、“三阴交”，探究其对蜕膜巨噬细胞极化水平的调节以及与改善子宫内膜厚度之间的关系。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

未交配过的健康SPF 级雌性SD 大鼠60 只，体质量（220±20）g，8-10 周龄，随机分为空白组、模型组、电针组，每组各20只；健康SPF级雄性SD大鼠15只，体质量（260±20）g，用于动情期合笼，由南京中医药大学实验动物中心提供，动物许可证号：SCXK（沪）2018-0006。昼夜交替节律各12 h，（22±2）℃，湿度55%±5%，自由摄食饮水。实验过程中涉及的动物处置均符合2006 年国家科技部发布的《关于善待实验动物的指导性意见》，并通过南京中医药大学伦理委员会审查（202004A018）。

1.2 主要仪器与试剂

华佗牌电子针疗仪（苏州医疗用品厂有限公司）；普通光学显微镜（日本奥林巴斯公司）；吸入式气体麻醉机（深圳瑞沃德生命科技有限公司）；高压蒸汽灭菌锅（美国致微公司）；流式细胞仪（美国碧迪公司）；PCR仪（德国耶拿公司）；台式高速冷冻离心机（德国海蒂诗公司）；优普超纯水机（南京优普实验仪器有限公司）；移液枪（美国赛默飞世尔公司）；计时器（菲亚斯家居制品有限公司）。

异氟烷（深圳瑞沃德生命科技有限公司）；无水乙醇（上海久亿化学试剂有限公司）；“0”号手术线（上海浦东金环医疗用品有限公司）；1 mm注射器（上海金钟手术器械有限公司）；4%多聚甲醛（宁波诺德生物科技公司）；F4/80 流式单克隆抗体（赛默飞世尔科技（中国）有限公司，货号：25-4801-82）；CD11b 流式抗体（美国碧迪公司，货号：561684）；CD86 流式抗体（美国碧迪公司，货号：551396）；CD206 流式抗体（美国碧迪公司，货号：565250）；Ⅳ型胶原酶（上海源叶生物有限公司）；1640 培养基（美国HyClone 公司）；PCR 试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；一次性无菌针灸针（0.25 mm×13 mm）（苏州医疗用品厂有限公司）。

1.3 造模方法

参考文献[18-19]以及课题组先前造模方法，于大鼠动情期制备薄型子宫内膜模型。雌性大鼠异氟烷麻醉后于子宫颈正上方约0.5 cm处行一长约1.0 cm的纵行切口。用镊子将一侧子宫分离后于两端结扎防止95%乙醇损伤卵巢和阴道。95%乙醇注入单侧子宫腔2 min 后吸出，并用生理盐水冲洗。将子宫恢复至正常位置后逐层缝合。

1.4 干预方法

电针组大鼠麻醉后行电针干预，参照《实验针灸学》[20]及《循证针灸治疗学》[21]取“关元”穴，单侧“子宫”穴，单侧“三阴交”穴。“子宫”穴，“三阴交”穴接一对电极（每日一侧，隔日交替），疏密波2/15 Hz，1 mA，持续15 min，每天1 次，连续干预4 个动情周期。空白组和模型组大鼠每日仅抓取麻醉。

1.5 观察指标及检测方法

各组大鼠干预结束后与雄鼠合笼，将观察到阴道栓或是阴道涂片中观察到精子作为妊娠第1 天，在妊娠第8天取材并对造模侧子宫相关指标进行检测。

1.5.1 动情周期检测

适应性饲养1 周后，每天上午固定时间行阴道涂片，并于显微镜下观察确定动情周期[22]：动情前期（Proestrus，P）视野中以大量有核上皮细胞为主，并伴有少量角化上皮细胞；动情期（Estrus，E）视野中满是角化上皮细胞堆叠；动情后期（Metestrus，M）多为角化上皮细胞和白细胞；动情间期（Diestrus，DI）视野中可见大量白细胞。

1.5.2 HE 染色观察子宫内膜形态、厚度及腺体和血管数目

取各组大鼠造模侧子宫，常规石蜡包埋，使用石蜡切片机将蜡块切成4 μm石蜡切片，脱蜡至水，HE染色，脱水，中性树胶封片，于显微镜下观察。

1.5.3 流式细胞术检测巨噬细胞极化水平

将新鲜的子宫组织于冰上剪成直径约1 mm 的团块后放到含3 mL 0.1% IV 型胶原酶和1 mL 0.001%DNA 酶I 的1640 培养基中，置于37℃，5% CO2恒温培养箱中消化40 min。消化液经100 μm 滤网过滤后制成单细胞悬液，用淋巴细胞分离液分离出单核细胞。避光条件下各组加入相应的流式抗体：F4/80 流式单克隆抗体；CD11b流式抗体；CD86流式抗体；CD206流式抗体，1 μL，室温孵育15 min，最后经2500 r·min-1离心5 min后弃上清，加入1 mL含2%胎牛血清的PBS上机检测。阴性染色用于筛选各组中阴性的细胞群体，F4/80 与CD11b 用于筛选出单核细胞中的巨噬细胞，CD86与CD206用于鉴定巨噬细胞的亚型。

1.5.4 qRT-PCR 检测子宫内膜中IGFBP-1、CD86 及CD206 mRNA表达量

于冰上刮取子宫内膜组织，每100 mg 组织加入1 mL 总RNA 提取液。使用超微紫外可见分光光度计测定RNA浓度与纯度，使用PCR试剂盒去除残留基因组DNA并进行逆转录，最后于PCR 反应器中进行PCR扩增。扩增条件为：升温（95℃，5 min，循环1次）、扩增（①95℃，10 s，②60℃，20 s，③72℃，20 s，循环40 次）、退火（①95℃，1 min，②55℃，30 s，③95℃，30 s，循环1 次）。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）为内参，引物序列见表1，数据处理采用2-ΔΔCT法。、

1.6 统计学方法

测得的实验数据中满足正态分布的实验数据使用均值±标准差（±s）来表示。采用单因素方差分析比较各组间数据，若方差齐性则采用LSD 法，若方差不齐则改为Dunnett's T3 法。不符合正态分布的等级资料与计量资料采用中位数、下四分位数、上四分位数表示，组间两两比较采用Kruskal-Wallis 秩和检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠动情周期比较

空白组大鼠动情周期规律，每个时相持续时间稳定。与空白组大鼠相比，模型组大鼠动情周期紊乱，动情期出现次数减少，动情后期与动情间期持续时间增加。与模型组大鼠相比电针组大鼠动情周期稍有恢复，动情期出现的频率有所增加，动情后期与动情间期持续的时间较模型组大鼠稍有减少。见图1。

图1 各组大鼠动情周期比较

2.2 各组大鼠胚胎着床个数比较

与空白组相比，模型组大鼠造模侧子宫中几乎无胚胎着床（P＜0.01）；与模型组相比，电针组大鼠造模侧子宫中着床胚胎数量明显增加（P＜0.05）。见图2。

图2 各组大鼠胚胎着床个数比较

2.3 各组大鼠子宫内膜形态、厚度、腺体和血管数的比较

空白组大鼠子宫内膜表面呈规律褶皱，上皮层、内膜层与浆膜层分界明显，各层细胞排列整齐规律、形态完整、无水肿；子宫内膜厚度较厚；腺体与血管丰富。与空白组相比，模型组大鼠子宫内膜全层变薄，内膜完整性遭破坏，细胞排列变的无序，形态趋于扁平；子宫内膜厚度明显降低（P＜0.01）；腺体数目及血管数目均减少（P＜0.01）。与模型组相比，电针组大鼠子宫内膜形态有所恢复；子宫内膜厚度提升（P＜0.01）；腺体及血管数目均增加（P＜0.01）。见图3，图4。

图3 各组大鼠子宫内膜形态比较

图4 各组大鼠子宫内膜厚度，腺体和血管数目比较

2.4 各组大鼠蜕膜巨噬细胞极化水平比较

与空白组相比，模型组大鼠子宫内膜中蜕膜巨噬细胞以M1 型巨噬细胞为主，M2 与M1 型巨噬细胞的比值明显降低（P＜0.01）。与模型组相比，电针组大鼠子宫内膜中蜕膜巨噬细胞以M2 型巨噬细胞为主，M2 与M1 型巨噬细胞的比值明显升高（P＜0.05）。见图5。

图5 各组大鼠蜕膜巨噬细胞极化水平比较

2.5 各组大鼠子宫内膜IGFBP-1、CD86 及CD206 mRNA表达比较

与空白组相比，模型组大鼠子宫内膜中IGFBP-1 mRNA 表达量明显下降（P＜0.01），CD86 mRNA 表达量明显上升（P＜0.01），CD206 mRNA 表达量明显下降（P＜0.01）。与模型组相比，电针组大鼠子宫内膜中IGFBP-1 mRNA 表 达 量 明 显 上 升（P＜0.01），CD86 mRNA 表达量明显下降（P＜0.05），CD206 mRNA 表达量明显上升（P＜0.05）。见图6。

图6 各组大鼠子宫内膜IGFBP-1、CD86及CD206 mRNA表达比较

3 讨论

薄型子宫内膜子宫间质细胞大量减少而导致以间质细胞增殖分化为主的蜕膜化进程受阻。而子宫内膜蜕膜化是子宫内膜接受胚胎所必须的过程[23]。电针的治疗使模型组大鼠子宫内膜厚度与组织形态得到明显改善，同时子宫内膜中IGFBP-1 的表达水平明显上升，表明电针对薄型子宫内膜有显著的修复作用并且促进了子宫内膜的蜕膜化水平，最终改善了胚胎着床的情况。在蜕膜化过程中，两种不同亚型的巨噬细胞分别发挥着不同的作用[24]。M1 型巨噬细胞主要以CD86 为表面标记物，其对机体外来物能产生最大的细胞毒性和炎症能力；M2型巨噬细胞主要以CD206为表面标记物，其对组织重塑以及免疫抑制起到关键作用[25]。在子宫内膜中分离出的单核细胞通过表面抗体F4/80 与CD11b 确定了巨噬细胞群体，通过M1 与M2 型巨噬细胞各自的表面标记物CD86 与CD206 对两种亚型的巨噬细胞数量进行比较后发现电针能使巨噬细胞极化水平朝M2方向偏移。

已有诸多研究证实了电针对全身各个组织的巨噬细胞均有调节作用，也有关于电针对薄型子宫内膜的治疗的研究[19,26]。本研究着眼于电针对子宫内膜组织蜕膜巨噬细胞的调节，发现电针“关元”，“子宫”，“三阴交”可以调节子宫内膜蜕膜巨噬细胞的极化水平，使蜕膜巨噬细胞朝M2 方向极化。M2 型巨噬细胞有促进组织再生与免疫抑制的功能，大量的M2 型巨噬细胞加快了薄型子宫内膜修复的进程，使子宫内膜间质细胞数目，腺体数目以及血管数目都有所增加。而蜕膜化的过程主要包括了子宫内膜间质细胞的增殖分化、腺体的分泌等，故电针在改善蜕膜巨噬细胞极化水平的同时促进了蜕膜化的进程。另一方面，M2型巨噬细胞能抑制机体的免疫反应，大量的M2 型巨噬细胞确保了胚胎不受母体免疫反应的攻击，能够顺利在子宫着床，这也是电针后着床胚胎数量增加的原因之一。

以往的研究虽然证实电针对薄型子宫内膜有一定的修复作用[27]，但是薄型子宫内膜患者想要解决的首要问题是胚胎无法顺利着床。过去的研究通常只关注电针对薄型子宫内膜的修复作用，忽视了对于妊娠结局的研究。本实验通过对薄型子宫内膜模型大鼠进行电针干预，观察其子宫中胚胎数量、子宫内膜修复情况以及蜕膜巨噬细胞极化水平，不仅将目光聚焦于电针对薄型子宫内膜修复作用，同时也探讨了电针对妊娠结局改善的作用，对内膜因素导致的不孕症的临床治疗更有指导意义。蜕膜巨噬细胞的极化水平是决定妊娠结局的重要因素[28]，目前对蜕膜巨噬细胞的研究十分有限，仍然存在研究的空白。目前已有大量的研究证明电针对全身各个组织中巨噬细胞极化有明确的调节作用[14-17]，但是鲜有研究探索电针对蜕膜巨噬细胞极化水平的调节作用。本研究创新性的将这两方面进行结合，填补了该领域的研究空白。在与西医疗法的疗效比较中，电针与激素替代疗法均能有效地促进薄型子宫内膜修复[29]，但激素替代疗法无法调节蜕膜巨噬细胞的极化水平，在这方面电针具有相对优势。

目前对于薄型子宫内膜的治疗临床大多采用激素替代疗法，但是对雌激素的使用剂量以及应用情况尚未达成共识。此外，激素疗法对肝肾功能有一定的损伤，若长期、大量服用激素药物可能导致肝肾功能损害、雌激素依赖性肿瘤、动静脉栓塞等风险[27,29]。电针疗法近年来作为辅助生殖的重要治疗方法在对薄型子宫内膜的治疗方面起了重要的作用[30]。与激素疗法相比，电针疗法不仅能有效地避免激素疗法副作用，还能减少患者的经济负担。更重要的是，电针疗法调节了蜕膜巨噬细胞极化水平，使M2 型巨噬细胞数量明显增多，其免疫抑制以及促进组织重塑的功能有效的帮助胚胎的着床，而常规的激素替代疗法无法实现对蜕膜巨噬细胞极化水平的调节，更值得临床推广。本实验的结论为电针疗法在内膜因素相关不孕症的临床推广应用提供了新的科学依据，也进一步丰富电针治疗不孕症的理论依据。

综上，电针对子宫内膜中蜕膜巨噬细胞极化水平具有调节作用，同时能促进薄型子宫内膜的修复，有利于胚胎着床。其作用可能是电针通过调节细胞之间的免疫调节网络，影响相应的细胞因子的分泌实现的[31]，其相关调节机制仍有待深入研究，同时临床数据的收集也有待在后续试验中进行。