CAR-T细胞免疫治疗结肠直肠癌的研究现状与展望

张天帅，周乐其 综述，于冠宇，张 卫 审校

（海军军医大学长海医院肛肠外科，上海 200433）

结肠直肠癌(colorectal cancer, CRC)在恶性肿瘤中发病率排名第三（占新发肿瘤病人的10.0%），且死亡率排名第二（占新增肿瘤死亡病人的9.4%）[1]。针对CRC 等实体肿瘤，传统治疗方式根据不同的类型与阶段，选择手术治疗、放疗、化疗以及靶向治疗等方式进行治疗[2]。但传统治疗方式对病人总生存期改善有限，CRC 发病率与死亡率仍高居不下。

近年来，免疫疗法的提出改变了以往直接针对肿瘤的治疗策略，并开辟了对抗肿瘤的另一路径——细胞免疫疗法[3]。其中，嵌合抗原受体T 细胞（chimeric antigen receptor T cell, CAR-T 细胞）免疫治疗是肿瘤治疗的创新方式之一。通过基因修饰，病人回输后的T 细胞可表达CAR，之后与独立于主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex, MHC)受体的靶抗原结合，得以定向识别和消除表达特定靶抗原的肿瘤细胞[4]。得益于良好的特异性和强大的杀伤作用，CAR-T 细胞免疫治疗方式在血液肿瘤治疗的临床应用中取得了显著成效，且在实体肿瘤治疗中具有极大的应用潜力。

1 CAR-T细胞免疫治疗CRC的靶点选择

在CAR-T 细胞免疫治疗CRC 过程中，CAR 与癌细胞表面靶抗原识别并结合是关键环节之一。寻找合适的治疗靶点是CAR-T 细胞免疫治疗得以开展的基石。Qi 等[5]报道的应用靶向密封蛋白（Claudin）18.2（CLDN18.2）CAR-T细胞对37 例胃肠道肿瘤治疗的Ⅰ期临床试验结果表明，在CLDN18.2 阳性表达的胃肠道肿瘤病人中获得良好的疗效和可接受的安全性。

治疗靶点的选择常需考虑肿瘤的组织病理特征，CRC肿瘤组织高表达的分子包括表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor, EGFR）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）以及磷酸酶张力蛋白同源物基因（phosphate and tension homolog,PTEN）表达的蛋白质等多种实体肿瘤标志物。目前，适用于CRC 的治疗靶点有癌胚抗原（carcinoembryonic, CEA）、鸟苷酸环化酶2C（guanylyl cyclase 2C, GUCY2C)、上皮细胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule, EpCAM）等[6]。综合来看，靶点选择策略有如下共同之处。

1.1 良好的特异性

CAR-T 细胞实现对肿瘤细胞的精准杀伤需要治疗靶点具有良好的特异性。急性淋巴细胞白血病等血液肿瘤细胞可普遍表达CD19 等肿瘤特异抗原（tumor specific antigen,TSA），与免疫细胞结合的特异性较高[7]。与之不同的是，实体肿瘤如CRC 肿瘤细胞缺乏TSA，更多的是肿瘤相关抗原(tumor associated antigen, TAA)作为治疗靶点。此类抗原在肿瘤细胞高水平表达，但在正常细胞也有一定的表达[8]。因此，利用TAA 在肿瘤细胞与正常细胞表达的差异来寻找合适的治疗靶点是提高治疗靶点特异性的主要策略。

GUCY2C 表达于胃肠上皮细胞，是治疗CRC 及转移性CRC 的重要靶点之一，在肠外细胞仅有下丘脑神经元少量产生，具有一定的组织特异性[9]。同时，GUCY2C 在原发性CRC 中可稳定表达，且在转移灶中也维持表达。与具有极性、仅于上皮细胞的腔面膜表达GUCY2C 的正常肠上皮细胞相比，恶变的上皮细胞因失去极性而造成GUCY2C 广泛表达于细胞整个表面[10]。这提高了GUCY2C 的特异性，使CAR-T细胞得以将其特异识别。

另一个在CRC 病人高表达的肿瘤相关抗原是CEA，其作为治疗靶点的原因与GUCY2C 相类似。在正常肠上皮细胞中，CEA 被糖蛋白或微绒毛包裹，且表达同样具有极性——仅在肠腔一侧细胞膜表达。细胞发生恶变后，CEA表达失去极性，在细胞整个表面都显著表达[11]。然而，CEA在肺癌、乳腺癌、胰腺癌等恶性肿瘤细胞中也可高表达，其组织特异性较差[12]。因此，CEA 被用作治疗靶点时，其安全性需要广泛的实验数据进行评价。

此外，还有EpCAM、人类表皮生长因子受体-2（human epidermal growth factor receptor-2, HER-2）等治疗靶点均因具有良好的特异性而被应用于CAR-T 细胞免疫治疗CRC[13-15]。

1.2 安全性和有效性

特异性筛选出治疗靶点后，还应进一步综合体外实验、动物实验、临床试验等结果评价其有效性和安全性。在不同实验阶段，可能会得出与预期不符的实验结果，影响治疗靶点选择的最终决策。良好的治疗靶点，应具有足够的安全性以及可观的有效性。

CEA 作为用于治疗CRC 的主要治疗靶点之一，在过去数十年间经历了相对完整的实验论证过程。Darcy 等[16]开展的一项实验将通过逆转录病毒转导的鼠嵌合scFv anti-CEA 受体T 细胞与人结肠癌LoVo 系细胞（效靶比=1∶1）混合培养，发现CAR-T 细胞与癌细胞特异结合并释放大量干扰素(interferon, INF)γ [（1 062±15） μg/L，对照组＜20 μg/L]，且在后续的动物实验中验证scFv anti-CEA 受体可在小鼠中扩增，并使CAR-T细胞对结肠癌细胞有效定位，之后通过穿孔素介导靶细胞裂解。Zhang 等[17]开展的一项anti-CEA CAR-T 细胞治疗转移性CRC 的Ⅰ期临床研究验证了CEA作为治疗靶点的安全性。研究未观察到与CAR-T细胞治疗相关的严重不良事件发生。此外，在入组的10 例病人中，既往发生疾病进展的7 例经CAR-T 细胞治疗后病情稳定，2例通过PET/CT 与MRI 检查提示病灶缩小，证明anti-CEA CAR-T细胞治疗CRC具有可观的有效性。

近年来，研究人员发现间皮素（mesothelin, MSLN）在间皮瘤、卵巢癌等肿瘤组织中高表达，而靶向MSLN 的CAR-T细胞免疫治疗也在动物实验阶段验证其有效性[18]。Zhang等[19]应用癌细胞系异种移植法（卵巢癌、乳腺癌和CRC 细胞系）和癌症病人细胞异种种植法（MSLN+CRC 和胃癌病人）分别造模癌症小鼠，之后应用anti-MSLN CAR-T细胞进行治疗。结果表明，anti-MSLN CAR-T 细胞免疫治疗不仅抑制实验组小鼠的肿瘤生长，同时提高小鼠体内T 细胞数目和抑癌细胞因子水平，体现了MSLN 作为新型细胞免疫治疗靶点的应用潜能。

尽管CEA 作为CAR-T 细胞免疫治疗的经典靶点经历了长时间的验证，但其有效性与安全性仍需更多的高等级临床证据深入论证，如更广泛、多中心的临床随机对照试验等。其他治疗靶点如MSLN 等也需如此，在理论走入实践、基础走入临床的各个环节反复验证其有效性及安全性。足够的安全性是治疗靶点得以广泛应用的必要条件，而治疗效果则是衡量治疗靶点临床收益的重要指标之一。

2 CAR-T细胞免疫治疗CRC的制约因素

CAR-T 细胞免疫在血液肿瘤治疗中取得了显著成效，然而，CRC 等实体肿瘤具有与血液肿瘤差异较大的抗原表达及肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME）。这些差异会导致CAR-T 细胞免疫治疗CRC 的应用过程中产生不良反应，也会降低治疗的有效性，成为制约CAR-T细胞免疫治疗CRC发展的因素。

2.1 制约治疗的不良反应

细胞因子释放综合征（cytokine release syndrome, CRS）是常发生于CAR-T细胞免疫治疗血液肿瘤的不良反应之一（on-target/on-tumor toxicity）[20]。其发生的主要原因是T细胞激活后介导的免疫反应，使巨噬细胞、树突状细胞等免疫细胞或上皮细胞释放出大量细胞因子[21]。然而，CRS 在CART细胞免疫治疗实体肿瘤时并不多见。Zhang等[17]的研究着重监测了CRS 的敏感标志物——C 反应蛋白与白介素(interleukin, IL)-6。结果表明，在回输CAR-T 细胞后呈单峰样抛物线变化趋势，并未高位维持，因此病人无严重的CRS发生。相同的结果还体现于Ahmed等[22]应用CAR-T细胞免疫治疗肉瘤的研究中，在对病人的细胞因子进行持续监测过程中，发现仅IL-8 在回输CAR-T 细胞后的第1、2、4 周有显著增高，其余细胞因子无明显增多，也未观察到严重的CRS发生。

在应用CAR-T 细胞免疫治疗实体肿瘤的过程中，更明显的不良反应是CAR-T细胞非特异性靶向而造成的机体损伤（on-target/off-tumor toxicity）。这是因为治疗如CRC 等实体肿瘤选取的治疗靶点为TAA，CAR-T 细胞回输后可能会对表达靶抗原的非肿瘤组织造成损伤。Morgan 等[23]报道，1例结肠癌术后淋巴及肝转移的病人在输注抗HER-2 CAR-T细胞后15 min内出现呼吸窘迫，并在5 d后死亡。分析认为CAR-T 细胞在回输后立即定位并攻击有ERBB2 低表达的肺上皮细胞，从而引发严重的CRS，并最终导致病人死亡。Parkhurst等[24]报道3例转移性CRC病人回输anti-CEA CART细胞后的治疗情况，3例病人CEA均有显著下降，1例肺转移灶及肝转移灶出现客观退缩，其余2 例肿瘤病灶无明显变化。此外，该治疗诱发了3 例严重短暂性炎性结肠炎，分析原因，认为是CAR-T 细胞识别了正常肠上皮细胞少量表达的CEA。

虽然CAR-T 细胞治疗靶点在临床试验之前严格筛选，也经过体外实验与动物实验，但免疫细胞回输后对病人产生的不良反应仍需大量的临床试验来深入研究，以便更安全、广泛地应用CAR-T细胞免疫治疗CRC。

2.2 制约治疗的肿瘤环境

肿瘤细胞的生活环境较复杂，包括有成血管细胞（内皮细胞、平滑肌细胞等）、免疫细胞（淋巴细胞、巨噬细胞等）、成纤维细胞，以及细胞外基质（extracellular matrix, ECM）、扩散性生长因子和细胞因子等[25]。这样的环境可使血管加速生成、成纤维细胞增殖，以及炎症细胞聚集等，形成的物理屏障及TME会制约CAR-T细胞杀伤肿瘤细胞[26]。

实体肿瘤的物理屏障限制了CAR-T 细胞的穿透能力。与血液肿瘤不同的是，CRC等实体肿瘤细胞呈团块样生长，阻碍了免疫细胞浸润。此外，肿瘤相关成纤维细胞（cancerassociated fibroblast, CAF）产生的肿瘤ECM 构成了另一重要的物理屏障[27]。ECM 由糖蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白等其他大分子物质组成，在肿瘤细胞外无序排列，这使得CAR-T细胞难以与肿瘤细胞靶向结合[28]。

实体肿瘤还具有免疫抑制效应的TME，由Treg细胞、骨髓源性抑制细胞（myeloid-derived suppressor cell, MDSC）、间充质干细胞（mesenchymal stem cell, MSC）等参与构建，降低CAR-T 细胞的杀伤能力[29-31]。其中，Treg 细胞发挥的免疫抑制效应更明显，其抑制效应主要体现如下：通过抑制性受体[T 淋巴细胞免疫球蛋白黏蛋白(T cell immunoglobulin domain and mucin domain,TIM)-3、T 细胞免疫球蛋白和ITIM 结构域蛋白(T-cell immunoreceptor with Ig and ITIM domain,TIGIT)、程序性死亡受体(programmed death, PD)-1 和淋巴细胞活化基因(lymphocyte activation gene,LAG)-3]、抑制性细胞因子[转化生长因子(transforming growth factor, TGF)-β、IL-10和IL-35)、调节树突状细胞释放吲哚胺2,3-双加氧酶(indoleamine 2,3-dioxygenase, IDO)[通过Treg 细胞的细胞毒性T 淋巴细胞相关蛋白 (cytotoxic T lymphocyte-associated antigen,CTLA)-4 与树突状细胞的抗原分化簇(cluster of differentiation,CD)80 结合]和中断腺苷代谢(通过Treg 细胞CD39 和CD73)来抑制抗肿瘤T 细胞反应；通过TGF-β 诱导CAF 增殖，增加ECM的产生与沉积，发挥物理屏障作用，限制CART细胞的浸润[32]。

实体肿瘤异于血液肿瘤的环境使得CAR-T细胞产生效应面临重重阻碍，这表明仍需探索合理的治疗策略，以克服实体肿瘤环境对CAR-T细胞免疫治疗的制约[33]。

3 CAR-T细胞免疫治疗CRC的展望

CAR-T细胞免疫治疗CRC疗效与其他实体肿瘤相比仍有一定差距，其制约因素主要为CRC的TAA，甚至TSA表达有限。Golubovskaya 等[34]探究anti-CD47 CAR-T 细胞抗肿瘤效能的体外及动物实验结果表明，肿瘤细胞系整体CD47表达显著高于正常细胞，但在CRC细胞系中表达却偏低，因此在动物模型实验中观察到CAR-T 细胞对卵巢癌、胰腺癌及宫颈癌良好的抗肿瘤效能，但对CRC 的治疗效果不佳。同时，CRC 具有更复杂的免疫微环境，也是CAR-T 细胞治疗CRC 效果与治疗其他实体肿瘤疗效产生差异的主要原因。另一可能影响治疗效果的因素是肿瘤的病理分期，然而目前CAR-T 细胞在实体肿瘤治疗中多用于较晚期的病人，缺少早期病人进行疗效比较。这一因素的探究依赖于产品成熟度的提升与较早期病人的应用。

目前，已有针对提高CAR-T 细胞免疫治疗靶点特异性以及突破TME 制约等问题的相关研究正在进行。如对CAR 结构进行改造，采用双重CAR 结构或串联CAR 结构，使CAR-T多靶点靶向结合肿瘤抗原后产生杀伤作用[35]。

此外，更多的治疗策略被提出，以期减轻TME对CAR-T细胞的影响。如对CAR-T 细胞进行改造，使其可以表达肝素酶，以降解肿瘤ECM，使CAR-T 细胞更有效地进入肿瘤组织[36]。还有研究将CAR-T 的靶细胞确定为CAF，通过特异性结合CAF 表面高度表达的成纤维细胞活化蛋白（fibroblast activation protein, FAP）对其造成杀伤[37-38]。

同时，创新给药途径也能提高CAR-T 细胞免疫治疗的有效性，如向肝内局部输注CAR-T 细胞，以增加局部浓度[39]。作为治疗肿瘤的方法之一，细胞免疫治疗还可与其他治疗方法联合应用，如将实体肿瘤手术切除后再行细胞免疫治疗，将治疗效果联合放大。但是，各种创新方案都需大量的临床试验进行验证，而这也是目前CAR-T 细胞免疫治疗的不足之一，期待未来开展更多的临床试验，获得更多积极的结果。

细胞免疫治疗作为对抗肿瘤的新一代治疗方法，对实体肿瘤的治疗极具应用潜力。因此，国家药品监督管理局药品审评中心于2020 年8 月组织起草了《人源性干细胞及其衍生细胞治疗产品临床试验技术指导原则（征求意见稿）》，进一步为开展细胞免疫治疗临床试验的研究者提供了针对性的指南。上海市政府更将细胞治疗列入上海市科技“十四五”及中长期规划的重点任务，上海市有多款CART 细胞治疗产品进入上市申报阶段。上海市斯丹赛生物开发的治疗CRC 等实体肿瘤anti-GCC CAR-T 细胞产品也于2022 年4 月被美国食品和药物管理局（Food and Drug Administration, FDA）授予快速通道资格。然而，实体肿瘤具有缺乏特异性抗原以及特殊的肿瘤环境等特点，产生一系列亟待解决的临床问题。在未来，需要对已掌握的技术进行广泛的验证，探索解决临床问题的全新途径。