自由基化学-串联质谱用于脂质精细结构解析的研究进展

简瑞君,瑕 瑜

(清华大学化学系,生命有机磷化学及化学生物学教育部重点实验室,北京 100084)

随着软电离技术,特别是电喷雾电离(electrospray ionization, ESI)的出现以及串联质谱(tandem mass spectrometry, MS/MS)的发展,实现了复杂脂质分子的高灵敏分析,推动了脂质组学在21世纪的迅速兴起[1-2]。2003年,Han和Gross提出[3],脂质组学是通过对生物体系脂质组进行全面地定性定量分析来揭示脂质生物学功能,阐明脂质代谢及其与疾病和健康联系的科学。脂质组学研究的内容主要包括:脂质定性(结构分析)和准确定量,脂质空间分布和动态变化,以及与其他生物分子的相互作用。脂质结构解析是脂质分析的基础,但脂质分子种类繁多、结构层次多、存在大量的异构体,这给质谱分析带来了极大的挑战。

1 脂质的多层次结构与分析挑战

图1 甘油磷脂多层次结构解析示意图Fig.1 Schematic diagram of multi-level structure analysis of glycerophospholipids

高分辨质谱和传统的低能碰撞诱导解离(collision-induced dissociation, CID)串联质谱(tandem mass spectrometry, MS/MS)技术通常只能提供前2个层次的信息,这是常规脂质组学所能达到的解析层面。而对于更深的结构层次,即脂质的精细结构,CID无法直接解析。近年来,基于异构体分辨的质谱技术发展迅速[5-6],主要分为新型气相离子活化技术和化学衍生结合CID串联质谱技术。自由基的活泼性使自由基诱导解离(radical-induced dissociation, RID)成为重要的离子活化技术,另外,还有许多基于自由基反应的化学衍生技术。本文将综述近10年来自由基诱导解离和自由基参与反应的衍生化方法结合串联质谱在脂质精细结构解析方面的应用。

2 自由基诱导解离

与偶电子离子的碎裂行为不同,电子电离(electron ionization, EI)会使离子源产生的自由基离子发生进一步碎裂得到丰富的结构信息[11]。基于此,对于通过软电离才能保持完整结构的蛋白质[12]、脂质[13]等生物分子,研究者采用多种方法使其在气相活化时产生自由基离子,经碰撞激活发生进一步碎裂得到更丰富的结构信息,即自由基诱导解离(RID)。脂质RID是指以不同方式形成缺电子脂质自由基离子,在碰撞活化中,自由基经由H·攫取过程转移至碳链,进而发生α-裂解,示于图2a。自由基诱导碎裂受电荷影响较小,相较于电荷远程碎裂,还可应用于复杂脂质链内修饰的鉴定。产生脂质自由基离子的方式主要有2类:1) 将自由基前体通过衍生引入脂质,以紫外光解离(ultraviolet photodissociation, UVPD)C—I键[11,14]或CID断裂低键能化学键[15-16]的方式在特定位置引入自由基,示于图2b,称为自由基定向解离(radical-directed dissociation, RDD);2) 高能粒子束与脂质离子作用诱导产生能量较高的不定点自由基离子,示于图2c,如有机物离子电子激发裂解(electron impact excitation of ions from organics, EIEIO)和亚稳态原子激发裂解(metastable atom-activated dissociation, MAD)。

注:EIEIO:有机物离子电子激发裂解;MAD:亚稳态原子激发裂解;CTD:电荷转移解离;HAD:氢原子攫取解离图2 自由基诱导碎裂途径(a),脂质离子产生定点(b)和不定点(c)自由基离子的方法Fig.2 Radical-induced fragmentation pathway (a), methods to generate site-specific (b) and nonspecific (c) lipid radical ions

2.1 紫外光解离C—I键

注:a.ai-17∶0-I-AMPP在266 nm下的UVPD谱图[14];b.[ai-17∶0-OBHA+Li]+的CID谱图[16]图3 不同自由基诱导解离方式对支链脂肪酸鉴定的串联质谱图Fig.3 MS/MS spectra for identification of branched chain fatty acids using different RDD methods

2.2 CID断裂低键能化学键

本课题组[24]发现,PC分子的磷酸胆碱头基可与碳酸氢根形成较强的氢键,生成的复合物在CID下会诱导胆碱内C—N键发生均裂,并形成以碳原子为中心的磷酸乙酯自由基。在优势构象的驱使下,高丰度RDD碎片离子为只含有sn-1位置酰基链的“sn-1诊断离子”。通过检测sn-1诊断离子可准确定量同时存在的PC的sn异构体,而无需分离异构体。向喷雾溶剂中加入碳酸氢铵可以直接用于解吸电喷雾电离(desorption electrospray ionization, DESI)成像[25],酰基链上的低丰度RDD碎片离子可用于PC和溶血磷酰胆碱(lysophosphatidylcholine, LPC)的链内修饰表征[26]。链内RDD成功整合到RPLC-MS系统,实现了对人血浆LPC 17∶0中iso和anteiso异构体的定性和相对定量分析。此外,该方法还被用于鞘磷脂(sphingomyelin, SM)中鞘氨醇骨架异构的鉴别[27]。

2.3 EIEIO产生脂质自由基离子

注:a.LPC 18∶1(9Z)和LPC 18∶0的EIEIO谱图[30];b.质子化PC 16∶1(9Z)/16∶1(9Z)和PC 16∶1(9E)/16∶1(9E)的EIEIO谱图中双键区域[33];黑点代表自由基碎片图4 EIEIO鉴定复杂脂质双键位置及顺反异构质谱图Fig.4 EIEIO spectra for identifying double bond positions and cis/trans isomers of complex lipids

2.4 其他气相活化方法

3 自由基相关衍生化方法-串联质谱

3.1 自由基为衍生化试剂的环氧化反应-MS/MS

注:a.环氧化-MS/MS碎裂;b.等离子体羟基自由基驱动环氧化反应;c.光引发苯甲酰过氧自由基环氧化;d.水自由基阳离子环氧化-MS/MS图5 以自由基为衍生化试剂的环氧化反应-MS/MSFig.5 Epoxidation reactions of free radicals as derivatization reagents-MS/MS

3.2 PB-MS/MS及自由基诱导异构化

图6 PB-MS/MS用于CC位置鉴定及自由基诱导异构化-LC用于CC构型分析Fig.6 PB-MS/MS for the identification of CC bond positions and radical-induced isomerization-LC for CC configuration analysis

4 结论与展望