免疫类器官在肿瘤免疫治疗中的研究进展

沈宇杰, 杨红, 徐盈, 李佳, 李远凤, 陈志浩, 陈紫均, 刘帅

1.西安医学院,陕西西安 710021;2.空军军医大学第一附属医院妇产科,陕西西安 710032

肿瘤微环境(tumor microenvironment,TME)是由多种类型的基质细胞、免疫细胞和细胞外成分构成的复杂环境。研究证明,TME会影响肿瘤进展及药物免疫治疗反应[1-2]。近几十年来,肿瘤研究主要依靠体外2D细胞培养及体内异种移植,二者均具有一定的局限性[3-4]。因此,建立新的研究模型至关重要。

免疫类器官是在肿瘤类器官的基础上,通过将肿瘤上皮细胞同各种基质和免疫成分共同培养,在保留患者肿瘤异质性的同时保留肿瘤的TME特征[5-7]。免疫类器官作为模拟体内免疫事件的可靠模型,可以为新的治疗方法提供研究平台,并对患者样本进行临床前筛查。本文对免疫类器官的培养方法,以及目前免疫类器官在肿瘤免疫治疗中的应用做一综述。

1 免疫类器官的不同培养方法

1.1 肿瘤类器官培养

目前肿瘤类器官培养的常用方法是浸没基质胶培养。首先无菌取样获得术中患者的肿瘤组织或腹水,经过机械切割和消化分离出肿瘤细胞,再将肿瘤细胞置于基质胶中培养。基质胶取材于小鼠肉瘤中的基底膜基质,其主要成分包括4种细胞外基质蛋白:层粘连蛋白、IV型胶原、巢蛋白和硫酸肝素蛋白聚糖,基质胶在22～37 ℃凝胶化,形成水凝胶,从而为上皮和内皮层细胞提供结构支持[8]。培养基根据肿瘤的类型及培养条件有所不同,常用的添加剂包括Wnt3a、R-spondin 1、表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)和骨形态发生蛋白抑制剂等[9],这种浸没基质胶培养的肿瘤类器官只富集上皮肿瘤细胞,不保留基质成分。

1.2 肿瘤类器官与免疫成分联合共培养

免疫类器官的培养需要在浸没基质胶培养的基础上添加外源性免疫细胞来达到TME建模。①首先建立肿瘤类器官,培养一段时间后,将肿瘤类器官解离为单个细胞,同时向解离的肿瘤类器官中添加由外周血提取的淋巴细胞,重悬于基质胶中再次接种。通过肿瘤类器官与外周血淋巴细胞共培养建立的免疫类器官可以富集肿瘤反应性T细胞[10]。Zhou等[11]通过胆管癌类器官与外周血T细胞共培养方案建立免疫类器官,成功在体外模拟了有效的抗肿瘤免疫应答反应。②另一种培养方式无需提前建立肿瘤类器官,只需将外源性的免疫细胞直接与肿瘤上皮细胞预混于基质胶中进行共培养,同样可以模拟免疫细胞与肿瘤细胞间的相互作用[12]。联合共培养的方式操作简便,但是需要外源性添加免疫成分,可能会存在免疫成分类型单一,无法反映不同免疫细胞间相互作用等问题;另外,共培养的培养条件需要根据不同肿瘤组织及添加的免疫成分进行调整。

1.3 微流控3D培养

微流控3D培养需要使用到微流控装置,装置使用塑料、玻璃或聚二甲基硅氧烷等柔性聚合物材料形成灌流中空微通道,通过操控通道中的微小流体,研究人员可以控制基质结构、细胞组成和比例、流速等特征。微流控的核心结构由微流体室构成,每个微流体室包含中心凝胶区及两侧的介质通道。具体的培养步骤是首先将新鲜肿瘤组织切碎消化制备成含有肿瘤细胞、免疫细胞和基质细胞的肿瘤微球,再将肿瘤微球与胶原水凝胶混合后注入中心凝胶区,从两侧的介质通道输入培养基[13]。微流控3D培养类器官包含自体肿瘤浸润性免疫细胞,有利于研究内源性免疫-肿瘤相互作用。此外,这种方式培养的类器官还可以实现动态培养,为细胞生长提供一个活跃且稳定的微环境,同时可以对细胞的形态和生理变化进行原位监测,更加真实地模拟TME,还原体内肿瘤特征[14]。但是,微流控3D类器官培养需要特殊装置,且模型目前仅限于研究内源性免疫-肿瘤相互作用,无法反映免疫细胞对肿瘤的募集[15]。

1.4 气液界面培养

气液界面(air liquid interface,ALI)培养是指将肿瘤组织采用物理方法切割成组织碎片,然后在包被胶原蛋白凝胶的穿透性细胞培养小室中进行培养。凝胶的顶部暴露在空气中,同时外皿中的培养基通过穿透性细胞培养小室扩散到内皿中,形成气-液交互界面,使细胞获得充足的氧气供应。该方法使肿瘤在原生状态下生长,保留了具有肿瘤实质和间质的复杂组织学TME结构及多种内源性免疫细胞,包括功能性的肿瘤浸润性淋巴细胞(tumor-infiltrating lymphocyte,TIL)[7]。由于气液界面培养无需外源性添加免疫成分且不需要特殊培养装置,因此实用性更高。目前ALI培养可以在短期内准确反应肿瘤的特征,但是随着时间的推移,类器官中的免疫成分会逐渐减少。研究显示,尽管在补充白细胞介素-2的条件下,其中的免疫成分也无法维持超过2个月的时间[7]。

2 免疫类器官在肿瘤免疫治疗中的各种应用

2.1 免疫检查点阻断治疗

免疫检查点分子是一组具有抑制免疫细胞功能的调节分子,对激活免疫系统、维持自身耐受和防止自身免疫的发生起着重要作用。免疫检查点分子无法使机体产生有效的抗肿瘤免疫应答,同时,在肿瘤组织中,肿瘤可以利用检查点形成免疫逃逸。免疫检查点抑制剂(immune checkpoint inhibitors,ICI)又称免疫系统反制点抑制剂,作用于免疫检查点,用于增强抗肿瘤免疫应答和抗免疫逃逸。

免疫类器官是对患者ICI治疗效果预测的理想平台,可以帮助决策患者的治疗方案。与此同时,免疫类器官可以帮助开展免疫治疗相关的功能测定,推动肿瘤免疫学机制的研究及精准医学的发展。在肿瘤类器官与自体TIL联合共培养建立的直肠癌免疫类器官中,TIL通过基质胶向类器官迁移,提高了肿瘤细胞的细胞毒性,这表明共培养类器官可以用来评估TIL的细胞毒性功能[16]。Cao等[17]使用共培养建立的高级别浆液性卵巢癌(high grade serous ovarian cancer,HGSOC)免疫类器官对抗靶向程序性死亡受体1(programmed cell death protein 1,PD-1)治疗的耐药机制展开研究,发现间质肿瘤浸润肥大细胞促进了抗PD-1治疗的耐药性,并与HGSOC的免疫逃逸亚型有关。Jenkins团队[18]使用微流控3D培养技术分别建立了小鼠来源和患者来源的免疫类器官,不但可以预测免疫检查点阻断(immune checkpoint blockade,ICB)治疗的效果,同时还捕获了与PD-1阻断反应和耐药性相关的关键特征。此外,ALI培养方法建立的人和小鼠的免疫类器官同样可以用于预测ICB治疗的效果[7]。

2.2 过继细胞免疫治疗

过继细胞免疫治疗通常是指从肿瘤患者体内分离免疫活细胞,在体外进行扩增和功能鉴定,然后向患者回输。如利用基因工程,将T细胞与肿瘤嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)结合,经过改造的嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor T cell,CAR-T)可以识别肿瘤抗原,从而达到直接杀伤肿瘤或激发机体免疫应答杀伤肿瘤细胞的目的[19]。CAR-T疗法在血液系统肿瘤中显示出强大的治疗效果,但对于实体肿瘤的疗效一直难以捉摸[20]。Schnalzger团队[21]成功模拟了嵌合抗原受体自然杀伤细胞92(chimeric antigen receptor-engineered natural killer-92 cells,CAR-NK-92)靶向肿瘤抗原EGF受体变异体III(EGF receptor variant III,EGFRvIII)和卷曲蛋白受体(frizzled,FZD)对结直肠癌(colorectal cancer,CRC)免疫类器官的肿瘤抗原特异性细胞毒性。Zou等[22]构建了T细胞与乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)共培养的肝细胞癌免疫类器官,并发现CD39+的HBVs-CAR-T细胞可以诱导类器官的凋亡。共培养免疫类器官在建立时具有高选择性,可作为开展CAR介导的免疫治疗研究的良好平台。

2.3 溶瘤病毒疗法

溶瘤病毒是一类能选择性感染和杀伤肿瘤细胞的病毒,可以保留非肿瘤性宿主细胞,直接溶解肿瘤细胞并将病毒传播到附近细胞,同时触发细胞因子的释放和免疫系统的激活,刺激机体产生抗肿瘤免疫反应[23]。Raimondi等[24]建立了正常胰腺类器官与胰腺导管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma,PDAC)肿瘤类器官,测试了类器官作为溶瘤腺病毒治疗筛选平台的可行性,结果显示溶瘤腺病毒具有良好的选择性,仅在PDAC类器官中复制;该研究还显示了溶瘤腺病毒的细胞毒性及与标准化疗协同作用的个体差异性,表明类器官可以作为溶瘤病毒治疗临床前反应的合适模型。此外,在一项基于乳腺癌(breast cancer,BC)类器官的研究中,研究者测试了麻疹疫苗病毒和痘苗病毒对于BC溶瘤治疗的效果,结果提示所有溶瘤病毒均显著抑制了BC类器官的存活[25]。借助类器官平台可以帮助测试和设计溶瘤病毒治疗方案,但目前基于溶瘤病毒研究所使用的是肿瘤类器官平台;肿瘤类器官在溶瘤病毒的传染性和细胞毒性方面均显示了良好的潜力,但尚缺乏溶瘤病毒引发免疫反应的实验研究,免疫类器官的应用也许可以为溶瘤病毒疗法带来新的希望。

2.4 联合治疗

免疫治疗逐渐开始聚焦于探索免疫联合疗法,比如利用多个免疫检查点和免疫抑制细胞群联合疗法、免疫治疗与放化疗联合治疗及ICI与分子靶向联合治疗等[26-28]。免疫类器官作为体外优势模型,在精确捕获肿瘤异质性的同时高度模拟TME,可以较为真实地反映患者体内的病理生理变化,为联合治疗的探索和疗效评估提供了有力平台。Jenkins等[18]利用微流控3D培养建立免疫类器官,发现TANK结合激酶1/kappa B抑制因子激酶ε抑制剂可以通过靶向抑制细胞因子信号通路,增强肿瘤细胞对PD-1阻断剂的反应;这种联合治疗模式可能为克服PD-1阻断剂耐药提供一种新的解决方案[18]。Usui等[29]利用ALI法建立了包含肿瘤干细胞的CRC免疫类器官,通过使用刺猬信号通路抑制剂抑制干细胞标记物c-Myc、CD44和Nanog的表达,可以逆转肿瘤对5-氟尿嘧啶和伊立替康的耐药性,抑制类器官的生长。免疫类器官可以提供一种操作性和准确性极高的平台,以开发新的联合治疗组合,推动临床转化,最终实现个性化免疫治疗。

3 结论与展望

在合适培养条件下,免疫类器官模拟的TME也许能做到包含完整的免疫细胞类型,接近真实地反映体内肿瘤上皮细胞-免疫细胞间的相互作用,从而评估免疫治疗反应。但是免疫类器官中的TME成分会随着时间部分丢失,如何使免疫细胞长期维持是一个亟待解决的问题。除此之外,免疫类器官的培养成功率主要取决于肿瘤类型和取材部位,在某些情况下,还会受到建立时间的影响[30],为了使免疫类器官成为有效的临床前决策工具,控制类器官的建立时间至关重要。

免疫类器官在模拟免疫治疗效果、研究耐药机制及开发新的联合治疗方案方面具有巨大潜力,相信随着培养方案的不断优化,免疫类器官可以推动肿瘤免疫治疗的临床转化,最终实现个性化免疫治疗。