海风藤化学成分及神经保护活性研究

徐瑞雯，范雨欣，朱 莹，张晓，薛贵民，曾梦楠,2，郑晓珂,2，冯卫生,2，陈 辉,2*

1. 河南中医药大学药学院，河南 郑州 450046

2. 呼吸疾病中医药防治省部共建协同创新中心，河南 郑州 450046

海风藤为胡椒科胡椒属植物风藤Piperkadsura(Choisy) Ohwi 的干燥藤茎，主产于浙江、福建、海南、广东、台湾等地。海风藤味辛、苦，性微温，归肝经，具有祛风湿，通经络，止痹病等功效[1-2]。化学成分研究表明海风藤含有木脂素、生物碱、挥发油、黄酮类、环氧化合物、甾体等成分，其中新木脂素和酰胺生物碱是其主要的化学成分[3-4]。现代药理研究表明海风藤具有抗炎、抗氧化、抑制血小板活化因子和神经保护等作用，特别是在治疗阿尔茨海默症和器官缺血再灌注等方面具有显著的药用价值[4-6]。文献研究表明海风藤水提物及醇提物可显著提高Aβ 诱导的阿尔茨海默症模型大鼠的学习记忆能力，有效改善其认知功能障碍[7-8]。但目前有关海风藤治疗阿尔茨海默症的研究多集中在总提取物或少量化合物。本课题组前期已对海风藤二氯甲烷部位的化学成分进行了初步研究[9-10]，为进一步揭示海风藤药理活性的化学物质基础，本实验综合利用各种现代色谱和光谱技术，对海风藤二氯甲烷及醋酸乙酯提取物进行系统的化学成分研究，共分离鉴定了22 个化合物，分别为puberulin（1）、(−)-acuminatin（2）、dihydrocarinatin（3）、海风藤酮（kadsurenone，4）、山蒟素C（hancinone C，5）、3-羟基苯甲酸苄酯（3-hydroxybenzyl benzoate，6）、2-羟基苯甲酸苄酯（2-hydroxybenzyl benzoate，7）、cherrevenol D（8）、trans-2,3-diacetoxy-1-[(benzoy1oxy)methyl]-cyclohexa-4,6-diene（9）、(3R,4R)-4-O-acetyl-5-(benzoyloxymethyl)cyclohexa-1,5-diene-3,4-diol（10）、(−)-sootepoxide chlorohydrin A（11）、香草醛（vanillin，12）、细辛醛（asaronaldehyde，13）、β-细辛醚（β-asarone，14）、α-细辛醚（α-asarone，15）、胡椒内酰胺D（piperolactam D，16）、焦谷氨酸甲酯（methyl pyroglutamate，17）、三羟基异黄酮（genistein，18）、去氢木香内酯（dehydrocostus lactone，19）、木香内酯（costuslactone，20）、spathulenol（21）、β-谷甾醇（β-sitosterol，22）。其中化合物3、6～8、19、20 为首次从胡椒属植物中分离得到，化合物15、21 为首次从海风藤中分离得到；化合物4 的13C-NMR 波谱数据为首次报道。Aβ25-35诱导PC-12 细胞损伤的神经保护作用研究显示，化合物2、4、19、21 对Aβ25-35诱导PC-12 细胞损伤具有显著保护作用，其半数效应浓度（median effective concentration，EC50）值分别为11.1、27.3、32.9、29.3 μmol/L。

1 仪器与材料

Bruker AVANCE III 500 型核磁共振仪、Bruker maxis HD 型飞行时间质谱（德国Bruker 公司）；N-1000 型旋转蒸发仪（上海爱朗仪器有限公司）；SHB-B95A 型循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；DFZ-3 型真空干燥箱（上海医用恒温设备厂）；Thermo Nicolet IS10 型红外光谱仪（美国热电公司）；LC52 型高压制备液相色谱仪（赛谱锐思北京科技有限公司，SP-5030 型半制备型高压输液泵，UV200 型紫外检测器，Easychrom 型色谱工作站；色谱柱为YMC-Pack ODS-A（250 mm×20 mm，5m）；Multiskan FC 型酶标仪（美国Thermo公司）；薄层色谱硅胶GF254、柱色谱硅胶（200～300 目，青岛海洋化工厂）；Sephadex LH-20（Pharmacia Biotech 公司）；ODS（40～60m，YMC 公司）；甲醇，色谱纯（天津市四友精细化学品有限公司）；其他试剂均为分析级；薄层色谱硅胶选用10～40m 的粒径，以0.5% CMC-Na 制板，阴干，105 ℃活化0.5 h。实时无标记细胞动态分析仪（安捷伦生物）；Aβ25-35（生工生物工程上海股份有限公司）；白藜芦醇（批号A10111，上海源叶生物科技有限公司）。

PC-12 细胞购于中国科学院上海细胞库。海风藤于2018 年6 月采购于安徽亳州药材市场，经河南中医药大学药学院陈随清教授鉴定为胡椒科胡椒属植物风藤P.kadsura(Choisy) Ohwi 的干燥藤茎。凭证样本（20180609I）存放于河南中医药大学中药化学研究室。

2 方法

2.1 提取与分离

海风藤药材粗粉（40 kg），二氯甲烷冷浸提取3次，每次24 h，继续用醋酸乙酯冷浸提取3 次，提取液经减压浓缩，得到二氯甲烷部位浸膏600 g，醋酸乙酯部位浸膏450 g。二氯甲烷部位总浸膏进行硅胶柱色谱分离，依次用石油醚-丙酮（100∶0→0∶100）梯度洗脱，得到13 个组分（Fr. 1～13）。Fr. 3（76 g）进行硅胶柱色谱分离，依次用石油醚-丙酮（100∶0→0∶100）梯度洗脱，得到2 个流分（Fr.3a～3b）。Fr. 3b 经ODS 柱色谱分离，依次用甲醇-水（30%～100%）梯度洗脱，得到7 个亚组分（Fr.3b-1～3b-7）。Fr. 3b-2（50%甲醇洗脱部位，38.6 g）经制备型HPLC 制备（65%甲醇-水）得化合物12（10.0 mg，tR＝38.4 min）、13（22.6 mg，tR＝42.9 min）。Fr. 3b-3 经制备型HPLC 制备（80%甲醇-水）得化合物21（5.0 mg，tR＝31.8 min）、11（2.0 mg，tR＝21.0 min）Fr. 6（32.5 g）经ODS 柱色谱分离，依次用甲醇-水（30%～100%）梯度洗脱，得到7个亚组分（Fr. 6-1～6-7）。Fr.6-4（70%甲醇洗脱部位，11.4 g）经制备型HPLC 制备（85%甲醇-水）得化合物1（4.0 mg，tR＝21.4 min）、8（5.7 mg，tR＝40.3 min）、9（10.3 mg，tR＝41.0 min）。Fr. 7（30.1 g）经ODS 柱色谱分离，依次用甲醇-水（30%～100%）梯度洗脱，得到9 个亚组分（Fr. 7-1～7-9）。Fr. 7-3（70%甲醇洗脱部位，13.5 g）经制备型HPLC制备（70%甲醇-水）制备得化合物10（2.5 mg，tR＝20.0 min）、2（9.5 mg，tR＝39.0 min）、3（3.5 mg，tR＝41.2 min）。Fr. 7-5 经硅胶柱色谱分离，依次用石油醚-丙酮（100∶0→0∶100）梯度洗脱，经制备型HPLC 制备（60%甲醇-水）得化合物4（20.0 mg，tR＝44.0 min）、5（3.4 mg，tR＝42.0 min）。

Fr. 8（38.8 g）经MCI 柱色谱分离，依次用甲醇-水（30%～100%）梯度洗脱，得到9 个亚组分（Fr.8-1～8-9）。Fr. 8-5（60%甲醇洗脱部位，18.1 g）经硅胶柱色谱分离，依次用石油醚：丙酮（50∶0→0∶100）梯度洗脱，得到7 个流分（Fr. 8-5a～8-5g）；Fr. 8-5e 经制备型HPLC 制备（60%甲醇-水）得化合物6（12.0 mg，tR＝28.0 min）、7（2.0 mg，tR＝22.0 min）、19（2.6 mg，tR＝23.0 min）。

Fr. 10（31.0 g）经硅胶柱色谱分离，依次用石油醚-丙酮（100∶0→0∶100）梯度洗脱，得到10个流分（Fr. 10-1～10-10）。Fr. 10-6（12.5 g）经MCI柱色谱分离，依次用甲醇-水（30%～100%）梯度洗脱，得到5 个亚组分（Fr. 10-6a～10-6e）。Fr. 10-6a（30%甲醇洗脱部位，4.8 g）经硅胶柱色谱分离，依次用石油醚-丙酮（50∶0→0∶100）梯度洗脱，经制备型HPLC 制备（70%甲醇-水）得化合物18（6.0 mg，tR＝27.0 min）、17（7.5 mg，tR＝46.0 min）、16（20.0 mg，tR＝57.0 min）。

醋酸乙酯部位总浸膏（450 g）经硅胶柱色谱分离，依次用石油醚-丙酮系统（50∶1→0∶100）梯度洗脱，得到8 个流分（Fr. A～H）。Fr. G（45.0 g）经硅胶柱色谱分离，依次用石油醚：丙酮（50∶0→0∶100）梯度洗脱，得到6 个组分（Fr. G-1～G-6）。Fr. G-3 经凝胶柱色谱分离得到6 个流分（Fr.G-3-1～G-3-6），Fr. G-3-3 经制备型HPLC 制备（30%甲醇-水）得化合物22（10.2 mg，tR＝30.0 min）。Fr.G-3-2 半制备型HPLC 制备（28%甲醇-水）得化合物20（2.0 mg，tR＝9.0 min）、14（2.6 mg，tR＝48.0 min）、15（2.3 mg，tR＝36.3 min）。

2.2 细胞培养

PC-12 细胞用含10%FBS 的1640 培养液培养，放置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，根据细胞生长状况，待细胞长至布皿80%时进行消化传代。每48 小时更换新鲜培养基，取对数生长期的细胞用于实验。

2.3 MTT 法检测化合物对Aβ25-35 诱导PC-12 细胞的保护作用

取生长状态良好，融合度为90%的PC-12 细胞，以2×104个/mL 接种于96 孔板中。培养24 h 后分为对照组、模型组（20 μmol/L Aβ25-35）、阳性药组（20 μmol/L Aβ25-35＋10 μmol/L 白藜芦醇）和各给药组（20 μmol/L Aβ25-35＋10 μmol/L 待测化合物），培养24 h 后，每孔加入MTT 溶液（5 mg/mL）20 μL，继续培养4 h，小心吸净培养液，每孔加入DMSO 150 μL，振荡10 min 使其完全溶解。酶标仪490 nm测定各孔吸光度（A）值。

2.4 实时无标记动态细胞分析技术（realtime cellular analysis，RTCA）检测化合物的EC50 值

取生长状态良好，融合度为90%的PC-12 细胞，以1×104个/mL，每孔200 μL 接种于16 孔板中。24 h 后分为对照组、模型组（20 μmol/L Aβ25-35）和不同浓度给药组（0.01、0.1、1、10、50、100 μmol/L待测化合物），继续培养72 h。细胞实时分析系统检测细胞活力，计算各化合物的EC50值[11]。

3 结构鉴定

化合物1：无色油状物，易溶于氯仿。ESI-MSm/z: 407 [M＋Na]+。1H-NMR (500 MHz, CDCl3)δ:6.89 (2H, d,J= 12.0 Hz, H-5′, 6′), 6.73 (2H, s, H-2,2′), 5.96 (2H, s, OCH2O), 5.85 (1H, ddd,J= 13.5, 6.5,1.0 Hz, H-10), 5.32 (1H, s, H-8), 5.16 (2H, dd,J=13.5, 1.0 Hz, H-11), 3.38 (3H, s, 1-OCH3), 3.05 (2H,d,J= 6.5 Hz, H-9), 2.98 (1H, s, H-5), 2.72 (1H, dt,J=8.5, 7.0 Hz, H-7), 2.42 (1H, d,J= 8.5 Hz, H-6), 2.21(3H, s, 8-OAc), 1.02 (3H, d,J= 7.0 Hz, 7-CH3)；13C-NMR (125 MHz, CDCl3)δ: 197.5 (C-4), 169.2(8-OAc), 148.8 (C-3′, 4′), 146.4 (C-2), 140.0 (C-1′),135.1 (C-3), 134.3 (C-10), 121.5 (C-6′), 117.6 (C-11),108.3 (C-5′), 108.1 (C-2′), 101.0 (OCH2O), 88.4(C-1), 75.1 (C-8), 60.7 (C-5), 54.0 (1-OCH3), 51.5(C-6), 46.6 (C-7), 32.4 (C-9), 21.2 (8-OAc), 13.1(7-CH3)。以上数据与文献报道一致[12]，故鉴定化合物1 为puberulin。

化合物4：无色油状物，易溶于氯仿。ESI-MSm/z: 379 [M＋Na]+。1H-NMR (500 MHz, CDCl3)δ:7.03 (1H, d,J= 1.7 Hz, H-2), 6.88 (2H, overlapped,H-5, 6), 6.22 (1H, d,J= 1.3 Hz, H-6′), 5.90 (1H, s,H-3′), 5.85 (1H, m, H-8′), 5.24 (1H, s, H-7), 5.13 (2H,m, H-9′), 3.91 (6H, s, 3, 4-OCH3), 3.14 (2H, m, H-7′),3.05 (3H, s, 5′-OCH3), 2.71 (1H, m, H-8), 1.14 (3H, d,J= 7.0 Hz, H-9)；13C-NMR (125 MHz, CDCl3) 显示了21 个碳信号，结合1H-NMR、HMBC 及HSQC首次归属了碳谱数据，结果如下：δ: 187.3 (C-2′),173.1 (C-4′), 148.8 (C-5), 148.6 (C-4), 142.7 (C-1′),135.1 (C-8′), 132.7 (C-6′), 132.0 (C-1), 118.2 (C-9′),117.2 (C-2), 110.7 (C-3), 109.0 (C-6), 104.7 (C-3′),94.7 (C-7), 81.2 (C-5′), 55.9 (3, 4-OCH3), 50.5(5′-OCH3), 46.8 (C-8), 33.3 (C-7′), 16.2 (C-9)。其理化性质及1H-NMR 波谱数据与文献报道一致[15]，故鉴定化合物4 为海风藤酮。

化合物5：白色结晶（氯仿）。ESI-MSm/z: 411[M＋Na]+。1H-NMR (500 MHz, CDCl3)δ: 6.98 (1H,s, H-7), 6.51 (1H, s, H-2), 6.51 (1H, s, H-5), 6.17 (1H,s, H-6′), 5.89 (1H, m, H-8′), 5.85 (1H, s, H-3′), 5.12(2H, t,J= 15.6 Hz, H-9′), 3.86 (9H, s, 3, 4, 5-OCH3),3.80 (3H, s, 4′-OCH3), 3.28 (3H, s, 5′-OCH3), 3.16(2H, m, H-7′), 1.70 (3H, d,J= 1.1 Hz, H-9)；13C-NMR (125 MHz, CDCl3)δ: 187.6 (C-2′), 173.4(C-4′), 152.8 (C-5), 141.9 (C-3, 1′), 139.5 (C-4), 136.7(C-1, 6′), 133.4 (C-7, 8′), 127.3 (C-8), 115.9 (C-9′),106.2 (C-6, 3′), 104.9 (C-2), 79.7 (C-5′),59.7(4′-OCH3), 55.4 (3, 4, 5-OCH3), 51.4 (5′-OCH3), 32.4(C-7′), 12.9 (C-9)。以上数据与文献报道一致[15]，故鉴定化合物5 为山蒟素C。

化合物6：淡黄色油状物，易溶于氯仿。ESI-MSm/z: 251 [M＋Na]+。1H-NMR (500 MHz, CDCl3)δ:8.11 (2H, d,J= 7.8 Hz, H-2′, 6′), 7.59 (1H, t,J= 7.3 Hz, H-4′), 7.47 (2H, t,J= 7.7 Hz, H-3′, 5′), 7.28 (1H,overlapped, H-5), 7.03 (1H, d,J= 7.5 Hz, H-6), 6.96(1H, s, H-2), 6.84 (1H, dd,J= 8.1, 2.5 Hz, H-4), 5.35(2H, s, H-7)；13C-NMR (125 MHz, CDCl3)δ: 166.5(C-7′), 155.8 (C-3), 137.7 (C-1), 133.1 (C-4′), 130.0(C-5), 129.9 (C-1′), 129.7 (C-2′, 6′), 128.4 (C-3′, 5′),120.2 (C-6), 115.2 (C-2), 114.9 (C-4), 66.3 (C-7)。以上数据与文献报道一致[16]，故鉴定化合物6 为3-羟基苯甲酸苄酯。

化合物7：淡黄色油状物，易溶于氯仿。ESI-MSm/z: 251 [M＋Na]+。1H-NMR (500 MHz, CDCl3)δ:8.09 (2H, d,J= 7.6 Hz, H-2′, 6′), 7.59 (1H, t,J= 7.4 Hz, H-4′), 7.46 (2H, t,J= 7.4 Hz, H-3′, 5′), 7.39 (1H,d,J= 7.4 Hz, H-6), 7.32 (1H, t,J= 7.7 Hz, H-4), 7.00(1H, d,J= 8.0 Hz, H-3), 6.95 (1H, t,J= 7.4 Hz, H-5),5.40 (2H, s, H-7)；13C-NMR (125 MHz, CDCl3)δ:168.7 (C-7′), 155.7 (C-2), 133.7 (C-4′), 132.2 (C-6),131.1 (C-4), 130.0 (C-2′, 6′), 129.2 (C-1), 128.5 (C-3′,5′), 121.7.(C-1′), 120.6 (C-5), 117.6 (C-3), 63.8 (C-7)。以上数据与文献报道一致[17]，故鉴定化合物7 为2-羟基苯甲酸苄酯。

化合物8：淡黄色油状物，易溶于氯仿。ESI-MSm/z: 311 [M＋Na]+。1H-NMR (500 MHz, CDCl3)δ:8.08 (2H, dd,J= 8.0, 1.3 Hz, H-2′, 6′), 7.58 (1H, t,J=8.0 Hz, H-4′), 7.47 (2H, t,J= 8.0 Hz, H-3′, 5′), 6.12(1H, d,J= 5.6 Hz, H-6), 6.08 (1H, dd,J= 9.4, 5.6 Hz,H-5), 5.88 (1H, dd,J= 9.4, 3.9 Hz, H-4), 5.54 (1H,dd,J= 7.6, 3.9 Hz, H-3), 5.09 (1H, d,J= 13.4 Hz,H-7a), 4.98 (1H, d,J= 13.4 Hz, H-7b), 4.55 (1H, d,J= 7.6 Hz, H-2), 2.09 (3H, s, H-2′′)；13C-NMR (125 MHz, CDCl3)δ: 171.1 (C-1′′), 166.4 (C-7′), 135.1(C-1), 133.2 (C-4′), 129.7 (C-2′, 6′), 129.7 (C-1′),128.5 (C-3′, 5′), 125.5 (C-5), 125.1 (C-6), 122.8 (C-4),75.1 (C-3), 70.2 (C-2), 64.7 (C-7), 21.3 (C-2′′)。以上数据与文献报道一致[18]，故鉴定化合物 8 为cherrevenol D。

化合物12：无色油状物，易溶于氯仿。ESI-MSm/z: 175 [M＋Na]+。1H-NMR (500 MHz, CDCl3)δ:9.85 (1H, s, H-7), 7.45 (1H, dd,J= 8.5, 1.5 Hz, H-6),7.44 (1H, d,J= 1.5 Hz, H-2), 7.07 (1H, d,J= 8.5 Hz,H-5), 3.99 (3H, s, 3-OCH3)；13C-NMR (125 MHz,CDCl3)δ: 190.9 (C-7), 151.7 (C-4), 147.1 (C-3), 129.8(C-1), 127.5 (C-6), 114.4 (C-5), 108.7 (C-2), 56.1(3-OCH3)。以上数据与文献报道一致[21]，故鉴定化合物12 为香草醛。

化合物13：白色粉末，易溶于氯仿。ESI-MSm/z:219 [M＋Na]+。1H-NMR (500 MHz, CDCl3)δ: 10.34(1H, s, H-7), 7.35 (1H, s, H-6), 6.51 (1H, s, H-3), 3.97(3H, s, 8-OCH3), 3.96 (3H, s, 9-OCH3), 3.88 (3H, s,10-OCH3)；13C-NMR (125 MHz, CDCl3)δ: 188.0(C-7), 158.7 (C-4), 156.8 (C-5), 143.5 (C-2), 117.4(C-1), 109.0 (C-6), 96.0 (C-3), 56.3 (10-OCH3),56.2 (8-OCH3), 56.2 (9-OCH3)。以上数据与文献报道一致[22]，故鉴定化合物13 为细辛醛。

化合物14：黄色油状物，易溶于氯仿。ESI-MSm/z: 231 [M＋Na]+。1H-NMR (500 MHz, CDCl3)δ:6.72 (1H, s, H-2), 6.56 (1H, s, H-5), 5.99 (1H, ddt,J=16.8, 10.4, 6.4 Hz, H-2′), 5.04 (2H, m, H-3′), 3.90(3H, s, 4-OCH3), 3.85 (3H, s, 3-OCH3), 3.83 (3H, s,6-OCH3), 3.35 (2H, d,J= 6.4 Hz, H-1′)；13C-NMR(125 MHz, CDCl3)δ: 151.4 (C-2), 147.9 (C-4), 143.0(C-3), 137.3 (C-2′), 120.1 (C-1), 114.0 (C-2), 98.1(C-5), 115.2 (C-3′), 56.6 (6-OCH3), 56.6 (4-OCH3),56.3 (3-OCH3), 33.7 (C-1′)。以上数据与文献报道一致[23]，故鉴定化合物14 为β-细辛醚。

化合物15：白色粉末，易溶于氯仿。ESI-MSm/z:231 [M＋Na]+。1H-NMR (500 MHz, CDCl3)δ: 6.96(1H, s, H-2), 6.67 (1H, dd,J= 15.8, 1.6 Hz, H-1′),6.51 (1H, s, H-5), 6.12 (1H, dq,J= 15.8, 6.6 Hz,H-2′), 3.83 (3H, s, 6-OCH3), 3.79 (3H, s, 3-OCH3),3.77 (3H, s, 4-OCH3), 1.91 (3H, d,J= 6.6 Hz, H-3′)；13C-NMR (125 MHz, CDCl3)δ: 150.7 (C-6), 148.7(C-4), 143.4 (C-3), 125.1 (C-1′), 124.4 (C-2′), 119.0(C-1), 109.8 (C-2), 98.0 (C-5), 56,7 (6-OCH3), 56.3(4-OCH3), 56.1 (3-OCH3), 18.8 (C-3′)。以上数据与文献报道一致[23]，故鉴定化合物15 为α-细辛醚。

化合物16：黄色晶体（甲醇）。ESI-MSm/z: 318[M＋Na]+。1H-NMR (500 MHz, CD3OD)δ: 9.36 (1H,m, H-5), 7.85 (1H, m, H-8), 7.48 (2H, m, H-6), 7.23(1H, s, H-9), 4.42 (3H, s, 4-OCH3), 3.95 (3H, s,3-OCH3)；13C-NMR (125 MHz, CD3OD)δ: 168.3(C-11), 153.1 (C-2, 4), 139.5 (C-3), 134.1 (C-10),133.2 (C-9a), 128.1 (C-8), 127.1 (C-5), 126.9 (C-5a),126.2 (C-4a), 125.5 (C-6), 124.8 (C-7), 111.7 (C-10a),105.9 (C-1, 9), 61.6 (4-OCH3), 60.6 (3-OCH3)。以上数据与文献报道一致[24]，故鉴定化合物16 为胡椒内酰胺D。

化合物17：无色晶体（甲醇）。ESI-MSm/z:144[M＋Na]+。1H-NMR (500 MHz, CD3OD)δ: 4.29 (1H,dd,J= 9.0, 4.4 Hz, H-5), 3.75 (3H, s, H-1′), 2.47 (1H,m, H-4), 2.33 (2H, m, H-3), 2.15 (1H, m, H-4)；13C-NMR (125 MHz, CD3OD)δ: 181.1 (C-2), 174.5(C-6), 57.1 (C-5), 52.9 (C-1′), 30.3 (C-3), 25.3 (C-4)。以上数据与文献报道一致[25]，故鉴定化合物17 为焦谷氨酸甲酯。

化合物18：黄色粉末，易溶于甲醇。ESI-MSm/z:293 [M＋Na]+。1H-NMR (500 MHz, CDCl3)δ: 8.04(1H, s, H-2), 7.37 (2H, d,J= 8.3 Hz, H-2′, 6′), 6.84(2H, t,J= 8.3 Hz, H-3′, 5′), 6.32 (1H, d,J= 2.0 Hz,H-8), 6.21 (1H, t,J= 2.0 Hz, H-6)；13C-NMR (125 MHz, CDCl3)δ: 180.8 (C-4), 165.2 (C-7), 162.2(C-5), 158.4 (C-4′), 157.4 (C-9), 153.3 (C-2), 130.0(C-2′, 6′), 122.0 (C-3), 123.3 (C-1′), 114.9 (C-3′, 5′),104.7 (C-10), 99.0 (C-6), 93.5 (C-8)。以上数据与文献报道一致[26]，故鉴定化合物18 为三羟基异黄酮。

化合物19：黄色油状物，易溶于氯仿。ESI-MSm/z: 255 [M＋Na]+。1H-NMR (500 MHz, CDCl3)δ:6.23 (1H, d,J= 3.4 Hz, H-13a), 5.51 (1H, d,J= 2.9 Hz, H-13b), 5.29 (1H, brs, H-15a), 5.09 (1H, brs,H-15b), 4.92 (1H, brs, H-14a), 4.84 (1H, brs, H-14b),3.98 (1H, t,J= 9.3 Hz, H-6), 2.94 (1H, overlapped,H-1), 2.90 (1H, overlapped, H-7), 2.88 (1H,overlapped, H-5), 2.53(1H, m, H-3b), 2.50 (1H,overlapped, H-9a), 2.50 (1H, overlapped, H-9b), 2.26(1H, m, H-8a), 2.18 (1H, m, H-8b), 2.23 (1H, m,H-3a), 1.97 (1H, m, H-2a), 1.89 (1H, m, H-2b)；13C-NMR (125 MHz, CDCl3)δ: 170.0 (C-12), 151.2(C-4), 149.2 (C-10), 139.8 (C-11), 120.2 (C-13), 112.6(C-14), 109.6 (C-15), 85.2 (C-6), 52.0 (C-5), 47.7(C-1), 45.1 (C-7), 36.3 (C-9), 32.6 (C-3), 30.9 (C-8),30.3 (C-2)。以上数据与文献报道一致[27]，故鉴定化合物19 为去氢木香内酯。

化合物20：黄色油状物，易溶于氯仿。ESI-MSm/z: 255 [M＋Na]+。1H-NMR (500 MHz, CDCl3)δ:6.25 (1H, d,J= 3.4 Hz, H-13b), 5.50 (1H, d,J= 3.0 Hz, H-13a), 4.83 (1H, d,J= 10.5 Hz, H-1), 4.72 (1H,d,J= 9.7 Hz, H-5), 4.55 (1H, t,J= 9.3 Hz, H-6), 2.55(1H, t,J= 9.3 Hz, H-7), 2.44 (1H, overlapped, H-9a),2.43 (1H, m, H-3b), 2.43 (1H, overlapped, H-9b), 2.31(1H, m, H-8a) , 2.29 (1H, m, H-3a), 2.27 (1H, m,H-8b), 2.02 (1H, m, H-2a), 1.99 (1H, m, H-2b), 1.66(3H, s, H-15), 1.40 (3H, s, H-14)；13C-NMR (125 MHz, CDCl3)δ: 170.4 (C-12), 141.4 (C-11), 140.1(C-4), 136.6 (C-10), 127.1 (C-5), 127.0 (C-1), 119.6(C-13), 81.9 (C-6), 50.4 (C-5), 41.3 (C-3), 39.5 (C-9),28.0 (C-2), 26.2 (C-8), 17.3 (C-15), 16.1 (C-14)。以上数据与文献报道一致[28]，故鉴定化合物20 为木香内酯。

化合物21：无色油状物，易溶于氯仿。ESI-MSm/z: 243 [M＋Na]+。1H-NMR (500 MHz, CDCl3)δ:4.70 (2H, d,J= 13.1 Hz, H-15), 2.44 (1H, dd,J=13.1, 6.1 Hz, H-1), 2.23 (1H, m, H-9a), 2.07 (1H, m,H-9b), 2.00 (1H, m, H-3a), 1.92 (1H, m, H-3b), 1.79(1H, m, H-5), 1.66 (1H, m, H-2a), 1.56 (1H, m, H-8a),1.55 (1H, m, H-2b), 1.34 (1H, m, H-8b), 1.30 (3H, s,H-14), 1.01 (3H, s, H-13), 0.99 (3H, s, H-12), 0.73(1H, m, H-7), 0.49 (1H, dd,J= 11.2, 9.5 Hz, H-6)；13C-NMR (125 MHz, CDCl3)δ: 153.4 (C-10), 106.3(C-15), 81.0 (C-4), 54.3 (C-5), 53.4 (C-1), 41.7 (C-3),38.9 (C-9), 30.0 (C-6), 27.5 (C-7), 26.7 (C-2), 26.1(C-14), 24.8 (C-8), 20.2 (C-12), 16.3 (C-13)。以上数据与文献报道一致[29]，故鉴定化合物21 为spathulenol。

化合物22：白色粉末，易溶于氯仿。ESI-MSm/z:437 [M＋Na]+。1H-NMR (500 MHz, CDCl3)δ: 5.36(1H, m, H-6), 3.54 (3H, m, H-3), 2.29 (2H, m, H-4),2.02 (1H, m, H-8), 1.87 (1H, overlapped, H-1a), 1.86(1H, overlapped, H-2a), 1.86 (1H, overlapped, H-7a),1.60 (1H, overlapped, H-7b), 1.60 (1H, overlapped,H-2b), 1.12 (1H, overlapped, H-1b), 0.93 (3H, s,H-19), 0.83 (3H, d,J= 6.5 Hz, H-21), 0.76 (3H, t,J=7.5 Hz, H-29), 0.75 (3H, d,J= 6.8 Hz, H-26), 0.73(3H, d,J= 7.0 Hz, H-27), 0.60 (3H, s, H-18)；13C-NMR (125 MHz, CDCl3)δ: 140.9 (C-5), 121.9(C-6), 72.0 (C-3), 56.9 (C-14, 17), 50.3 (C-9), 46.3(C-24), 42.5 (C-13, 4), 40.0 (C-12), 37.4 (C-1), 36.7(C-10), 36.5 (C-20), 34.5 (C-28), 32.1 (C-8), 31.8(C-2, 7), 29.5 (C-25), 28.9 (C-16), 26.3 (C-22), 24.5(C-15), 23.2 (C-23), 21.2 (C-11), 20.2 (C-27), 20.0(C-21), 19.8 (C-19), 19.5 (C-26), 19.2 (C-29), 12.1(C-18)。以上数据与文献报道一致[21]，故鉴定化合物22 为β-谷甾醇。

4 对Aβ25-35 诱导PC-12 细胞损伤的保护作用

体外建立Aβ25-35诱导PC-12 细胞损伤模型，对海风藤中分离鉴定的部分新木脂素类化合物（1～4）和倍半萜类化合物（19、21）进行活性筛选。结果显示，在10 μmol/L 浓度下，与对照组相比，化合物2、4、19、21 可显著提高PC-12 细胞活力（P＜0.05、0.01，图1），其EC50值分别为11.1、27.3、32.9、29.3 μmol/L，阳性对照药白藜芦醇的EC50值为14.3 μmol/L。

5 讨论

本实验从海风藤二氯甲烷和醋酸乙酯提取物中分离鉴定了22 个化合物，其中化合物1～5 为新木脂素类化合物，化合物6～15 为芳香酯、芳香醛及简单苯丙素类化合物，化合物16、17 为酰胺生物碱类化合物，化合物18 为异黄酮类化合物，化合物19～22 为倍半萜及甾体类化合物。其中，化合物3、6～8、19～20 为首次从胡椒属中分离得到，化合物15、21 为首次从海风藤中分离得到。其中化合物4 的13C-NMR 波谱数据为首次报道。体外神经保护活性结果表明新木脂素类化合物（2、4）和倍半萜类化合物（19、21）对Aβ25-35诱导PC-12 细胞损伤具有显著保护作用。本研究不仅进一步丰富了海风藤中化学成分的结构多样性，而且对海风藤在治疗和预防阿尔茨海默症等神经退行性疾病方面的研究具有一定的参考价值。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突