基于紫外可见分光光度法的健身肌酸粉中肌酸的检测研究

杨焕欣,柏群力,尹琢,王琨琦

(长春工程学院 理学院,长春 130012)

0 引言

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

TU-1810DSPC型紫外可见分光光度计(北京普析有限公司)、1 cm石英比色皿、AL104型万分之一电子天平(梅勒特-托利多仪器上海有限公司)、PHS-3C型pH计(雷磁有限公司)、MC 350型加热型磁力搅拌器(瑞士 Salvis公司)。玻璃仪器:25 mL比色管,250 mL、100 mL烧杯,100 mL、250 mL容量瓶,25 mL、5 mL、2 mL、1 mL移液管,100 mL量筒,普通漏斗。标准品肌酸(上海阿拉丁生化技术公司)、氢氧化钠(天津市鑫铂特化工有限公司)、甲醇(天津市鑫铂特化工有限公司)和盐酸(西陇科学股份有限公司),前面试剂均为分析纯。健身肌酸粉Ⅰ(市面购买)、健身肌酸粉Ⅱ(超市购买),水为超纯水(电阻率≥18 MΩ)。

1.2 酸性肌酸标准水溶液配制

1)3.00 mol/L盐酸溶液的配制:量取浓盐酸25.00 mL置于100 mL烧杯中,缓慢加入适量超纯水稀释,然后移入100 mL容量瓶中,用超纯水定容。

2)0.90 mol/L盐酸溶液的配制:用25 mL移液管移取3.00 mol/L的盐酸15.00 mL置于50 mL容量瓶中,用超纯水定容。

3)pH=2.50肌酸标准液的配制:在装有适量超纯水的100 mL烧杯中加入0.500 0 g标准品肌酸,置于磁力搅拌器上搅拌溶解,待溶解完全后移入100 mL容量瓶中,随后加入3.00 mol/L的盐酸溶液2.00 mL,用超纯水定容至刻度线。

4)pH=4.00肌酸标准液的配制:在装有适量超纯水的100 mL烧杯中加入0.500 0 g标准品肌酸,置于磁力搅拌器上搅拌溶解,待溶解完全后移入100 mL容量瓶中,随后加入0.90 mol/L的盐酸溶液2.00 mL,用超纯水定容至刻度线。

5)pH=6.22肌酸标准液的配制:在装有适量超纯水的100 mL烧杯中加入0.500 0 g标准品肌酸,置于磁力搅拌器上搅拌溶解,待溶解完全后移入100 mL容量瓶中,用超纯水定容至刻度线。

1.3 碱性肌酸标准水溶液配制

1)1.00 mol/L氢氧化钠溶液的配制:在250 mL的烧杯中加入1.000 0 g氢氧化钠,再加入适量超纯水,置于磁力搅拌器上搅拌,待溶解完全后移入250 mL容量瓶中,用超纯水定容至刻度线。

2)pH=9.00肌酸标准液的配制:在装有适量超纯水的100 mL烧杯中加入0.500 0 g标准品肌酸,置于磁力搅拌器上搅拌,待溶解完全后移入100 mL容量瓶中,随后加入1.00 mol/L的氢氧化钠溶液0.50 mL,用超纯水定容至刻度线。

3)pH=9.76肌酸标准液的配制:在装有适量超纯水的100 mL烧杯中加入0.500 0 g标准品肌酸,置于磁力搅拌器上搅拌,待溶解完全后移入100 mL容量瓶中,随后加入1.00 mol/L的氢氧化钠溶液1.00 mL,用超纯水定容至刻度线。

4)pH=10.66肌酸标准液的配制:在装有适量超纯水的100 mL烧杯中加入0.500 0 g标准品肌酸,置于磁力搅拌器上搅拌,待溶解完全后移入100 mL容量瓶中,随后加入1.00 mol/L的氢氧化钠溶液1.50 mL,用超纯水定容至刻度线。

5)pH=11.96肌酸标准液的配制:在装有适量超纯水的100 mL烧杯中加入0.500 0 g标准品肌酸,置于磁力搅拌器上搅拌,待溶解完全后移入100 mL容量瓶中,随后加入1.00 mol/L的氢氧化钠溶液2.00 mL,用超纯水定容至刻度线。

1.4 5.00 mg/mL肌酸标准水贮备液的配制

在装有适量超纯水的100 mL烧杯中加入标准品肌酸0.500 0 g,置于磁力搅拌器上搅拌至全部溶解,将前述溶液移入至100 mL容量瓶中,用超纯水定容至刻度线,于冰箱中低温保存。

1.5 5.00 mg/mL肌酸标准甲醇贮备液的配制

通风橱中,用量筒量取40.00 mL甲醇置于250 mL烧杯中,然后边搅拌边加入160.00 mL超纯水,配置成体积比V(甲醇)∶V(水)=20∶80的甲醇溶液,准确称取标准品肌酸0.500 0 g置于100 mL烧杯中,再加入前述配好的V(甲醇)∶V(水)=20∶80溶液,置于磁力搅拌器上搅拌至全部溶解,最后将此溶液移入100 mL容量瓶中,继续用V(甲醇)∶V(水)=20∶80溶液定容至刻度线,置于冰箱中低温保存。

1.6 肌酸标准甲醇溶液的配制(现用现配)

分别移取0.50 mL、1.00 mL、2.00 mL、3.00 mL、4.00 mL和5.00 mL的5.00 mg/mL肌酸标准甲醇贮备液于25 mL比色管中,用V(甲醇)∶V(水)=20∶80溶液定容至刻度线,于是溶液中肌酸的质量浓度分别为100.00 μg/mL、200.00 μg/mL、400.00 μg/mL、600.00 μg/mL、800.00 μg/mL和1000.00 μg/mL。

1.7 健身肌酸粉的处理

移取适量的健身肌酸粉置于100 mL烧杯中,加入V(甲醇)∶V(水)=20∶80溶液80.00 mL,置于磁力搅拌器上搅拌,待健身肌酸粉完全溶解后移至100 mL容量瓶中,用V(甲醇)∶V(水)=20∶80溶液定容至刻度线。

2 结果与讨论

2.1 肌酸标准水溶液对pH的响应

将pH为2.50、4.00、6.22、9.00、9.76、10.66和11.96的肌酸标准水溶液分别注入至1 cm石英比色皿中,以超纯水为参比,在190.00～300.00 nm范围内进行紫外可见分光光度扫描,绘得pH-肌酸最大吸收波长曲线(图1)。如图1所示,肌酸在酸性体系(pH=2.50～6.22)中紫外吸收波长随pH的增大而减小,分别为225.00 nm、224.00 nm和222.50 nm,但是变化不明显,主要集中在223.00 nm处,因此在酸性范围内,pH对肌酸紫外吸收波长的影响不大。但当pH在6.22～9.00时,紫外吸收波长蓝移至209.50 nm。pH继续增加至11.96时,紫外吸收波长为210.50 nm。

图1 pH-肌酸最大吸收波长图

2.2 肌酸标准水溶液的稳定性研究

移取适量的5.00 mg/mL肌酸标准水溶液注入至1 cm石英比色皿中,以超纯水为参比,在190.00～300.00 nm范围内进行紫外可见分光光度扫描,每隔5 min做1次紫外可见分光光度扫描,共测13次,总计1 h。所有数据测完后分析可得0～60 min内肌酸标准水溶液的最大吸收波长分别为211.00 nm、214.00 nm、212.00 nm、209.00 nm、211.00 nm、212.00 nm、210.00 nm、214.00 nm、209.00 nm、209.00 nm、213.00 nm和210.00 nm,确定肌酸标准水溶液的紫外吸收适宜波长为210.00 nm,以时间为横坐标,以210.00 nm波长下的吸光度为纵坐标,绘制肌酸标准水溶液时间-吸光度曲线(图2)。由图2可知,0～25 min内随着时间的增加,210.00 nm处的吸光度逐渐升高,当时间>25 min后,其吸光度逐渐降低;45～60 min内吸光度趋于稳定,表明25 min是肌酸标准水溶液的最佳显色时间。

图2 肌酸标准水溶液时间-吸光度图

2.3 肌酸标准溶液对不同溶剂的反应

在1 cm石英比色皿中,加入适量5.00 mg/mL的肌酸标准水贮备液,以超纯水为参比,在190.00～300.00 nm的波长范围内进行紫外可见分光光度扫描。另取1个1 cm石英比色皿加入适量5.00 mg/mL的肌酸标准甲醇贮备液,以V(甲醇)∶V(水)=20∶80溶液为参比,重复前述紫外扫描,使用两次测试结果绘制出不同溶剂中肌酸标准品的紫外可见分光光度曲线(图3)。由图3可知,210.00 nm处甲醇体系中肌酸标准品贮备液的吸光度高于水体系中肌酸标准品贮备液的吸光度,表明对于肌酸的紫外吸收来说,V(甲醇)∶V(水)=20∶80溶剂更利于肌酸的紫外吸收,后续试验均采用肌酸的甲醇体系(V(甲醇)∶V(水)=20∶80)。

图3 不同溶剂中5.00 mg/mL肌酸标准品的紫外可见分光光谱图

2.4 肌酸标准曲线的绘制

分别在1 cm石英比色皿中加入100.00 μg/mL、200.00 μg/mL、400.00 μg/mL、600.00 μg/mL、800.00 μg/mL和1 000.00 μg/mL的肌酸标准甲醇溶液,以V(甲醇)∶V(水)=20∶80溶液为参比,放置25 min,在210.00 nm波长处进行紫外分光光度检测,读取不同质量浓度肌酸的吸光度。然后以肌酸质量浓度为横坐标,吸光度为纵坐标,绘制标准曲线(图4)。由图4可知,肌酸在200.00～1 000.00 μg/mL浓度范围内与其吸光度线性相关,线性方程为Y=1.525×10-4X+2.4099,相关系数r=0.995 37。根据公式检出限=Ks/b[6],其中K为3,s为10次空白值的标准偏差,b为前述标准曲线的斜率,计算出检出限为65.60 μg/mL,同时获得检出下限为262.40 μg/mL。

图4 肌酸的标准曲线图

2.5 紫外分光光度法检测健身肌酸粉Ⅰ、健身肌酸粉Ⅱ中肌酸的含量

称取0.050 5 g健身肌酸粉Ⅰ按照前述健身肌酸粉处理方法进行处理,以V(甲醇)∶V(水)=20∶80溶液为参比,在1 cm石英比色皿中,加入适量处理好的健身肌酸粉Ⅰ,放置25 min,在210.00 nm波长处进行紫外分光光度的检测,测得健身肌酸粉Ⅰ的吸光度为2.449,代入标准曲线Y=1.525×10-4X+2.409 9,计算出健身肌酸粉Ⅰ中肌酸的质量浓度为256.00 μg/mL。称取0.048 8 g的健身肌酸粉Ⅱ重复前述的测试过程,测得健身肌酸粉Ⅱ的吸光度为2.462,计算出健身肌酸粉Ⅱ中肌酸的质量浓度为342.00 μg/mL。

2.6 健身肌酸粉Ⅱ的加标回收率

在最优条件下,按照前述试验方法对健身肌酸粉Ⅱ进行测定,并做加标回收率试验,结果见表1。由表1可知,其加标回收率为97.70%～102.60%,均值为100.15%。

表1 健身肌酸粉Ⅱ的加标回收率

2.7 干扰因素分析

根据国家标准,健身肌酸粉中除必须添加含量>99%的肌酸外,还建议少量添加谷氨酰胺、1,6二磷酸果糖和β-羟基-β-甲基丁酸钙等成分。如果在待测健身肌酸粉中添加谷氨酰胺,酰胺键在210 nm处也可产生紫外吸收峰,会影响肌酸的检测分析。如1,6二磷酸果糖被加入到被测健身肌酸粉中,由于酮糖的最大紫外吸收峰在300 nm附近[7-8],不会对肌酸210 nm处的紫外测试产生影响。杨涛等[9]研究表明β-羟基-β-甲基丁酸钙在214 nm处有最大紫外吸收峰,该峰与肌酸的紫外吸收峰过于接近,一旦健身肌酸粉中混有β-羟基-β-甲基丁酸钙不建议采用前述方法分析检测肌酸的含量。

3 结语

紫外可见分光光度法适合在V(甲醇)∶V(水)=20∶80的体系中进行肌酸的检测,其显色时间为25 min,最大紫外吸收波长是210.00 nm,在200.00～1 000.00 μg/mL范围内,肌酸质量浓度与吸光度线性相关。采用紫外可见分光光度法分析健身肌酸粉Ⅰ、健身肌酸粉Ⅱ的肌酸含量分别为256.00 μg/mL和342.00 μg/mL,换算成质量分数分别为50.60%和70.00%。当对健身肌酸粉中的肌酸含量进行分析时,务必注意配料表中的额外添加成分,如添有谷氨酰胺和β-羟基-β-甲基丁酸钙,尽管紫外可见分光光度法简单、快速、易操作,也不建议用它测定健身肌酸粉样品中的肌酸含量。