一次性使用卫生用品中致病菌的检测和质量控制

钟静 杨立峰 杨文润 邓颖敏 广东省医疗器械质量监督检验所 （广东 广州 510663）

内容提要： 目的：通过参加国家市场监督管理局组织的一次性口罩能力验证，评估实验室综合检测能力，进而提升一次性口罩的产品质量安全。方法：依据《一次性使用卫生用品中致病菌的检测参试指导书》及GB15979-2002《一次性使用卫生用品卫生标准》附录B的相关条款进行检测，在菌株分离上采用辅助检测方法：增加金黄色葡萄球菌、假单胞菌属显色培养基的划线，目的增加对目标菌的分离和准确鉴定。采用标准要求用传统生化鉴定方法对血平板、十六烷三甲基溴化铵琼脂培养基分离出来的可疑菌落进行生化鉴定，同时也对辅助检测方法显色平板分离出来的可疑菌落进行传统鉴定，对难判定的假单胞菌属显色培养基生长的可疑菌落再增加全自动生化鉴定仪进行生化鉴定。结果：传统方法鉴定结果与全自动生化鉴定仪鉴定的结果一致，国家市场监督管理局于2020年及2022年共组织了2次一次性口罩能力验证实验，本实验室能力验证结果评价均为满意，实验室的检测能力获得认可。结论：本实验室一次性口罩能力验证的检测方法及质量控制策略是可行的，值得推荐。

一次性使用卫生用品是指使用一次后即丢弃的、与人体直接或间接接触的并为达到人体生理卫生或卫生保健（抗菌或抑菌）目的而使用的各种日常生活用品，依据GB15979-2002标准口罩是一次性卫生用品[1]。对于呼吸道传染病最有效最重要的防疫手段就是隔离，而医用口罩的特殊性在于共有三层过滤层，可以有效隔离细菌、病毒等飞沫传播，它能阻止经空气传播的直径小于5μm的感染因子，或1m内接触经飞沫传播的疾病，所以最有用的防疫物资就是口罩，GB15979-2002标准中4.3微生物学指标规定，普通级或消毒级口罩均不得检出致病性化脓菌，而金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌（原称绿脓杆菌）就是“致病性化脓菌”中最常见的两种条件致病菌，也是人类化脓感染中最常见的病原菌，在自然环境中存在较多，检出率较高，受其污染的用品可引起局部化脓感染[2-4]。口罩是二类医疗器械，直接接触到人体的皮肤及黏膜，一旦检出上述致病菌，将直接影响使用者的身体健康，因此，对其致病菌等卫生质量指标进行检测具有非常重要的意义[5,6]。参加室外能力验证能满足CNAS评审要求及提高本实验检测能力[7]。本实验室于2020年及2022年均参加了由国家市场监督管理局组织的一次性使用卫生用品致病菌检测能力验证，2020年样品中添加的干扰菌较少，目标菌添加的量浓度较高，容易判断结果，2022年的样品中添加的干扰菌较多，目标菌添加的量较少，要经过多次分离才能获得目标菌，检测时间紧，要求实验室检测人员不仅要有丰富的检测经验而且对质量控制要严谨把关[8]。本实验室两次实验结果均为满意，本文通过对实验过程中遇到的各种情况进行分析，探讨影响检测结果的质量控制因素进行总结，希望能助力企业高质量发展提供一些帮助。

1.材料与方法

1.1 一般材料

试剂及菌种：①金黄色葡萄球菌检测需用的试剂：SCDLP液体培养基、血平板、营养肉汤培养基、甘露醇生化鉴定管、冻干血浆、金黄色葡萄球菌显色培养基一次性使用平板、胰酪大豆胨琼脂一次性使用平板、革兰氏染色液、0.9%无菌氯化钠注射液；革兰氏阳性菌鉴定卡片。②绿脓杆菌检测需用的试剂：十六烷三甲基溴化铵琼脂培养基、胰酪大豆胨琼脂一次性使用平板、革兰氏染色液、绿脓杆菌生化鉴定盒、氯仿、1N盐酸；GN革兰氏阴性细菌鉴定卡片、铜绿胞菌属显色培养基。③金黄色葡萄球菌检测需用的标准菌株：阳性菌株：金黄色葡萄球菌；阴性菌株：表皮葡萄球菌。④绿脓杆菌检测需用的标准菌株：阳性菌株：铜绿假单胞菌；阴性菌株：大肠埃希氏菌。

仪器设备：生化培养箱、电子天平、立式灭菌器、生物安全柜、双目光学显微镜、全自动微生物鉴定及药敏分析系统、比浊仪、冰箱。

1.2 方法

1.2.1 供试液的制备

样品从冰箱中取出后，待样品恢复到室温后开启使用，在生物安全柜内无菌开启样品包装，用无菌镊子取出样品放置于已灭菌的1L量杯中剪碎，用无菌镊子将剪碎的样品移至到100mL无菌氯化钠注射液中振摇，时间不低于2min，全过程在15min内完成。将此溶液依据GB15979-2002标准进行绿脓杆菌及金黄色葡萄球菌的后续检测。

1.2.2 增菌

将上述供试液，无菌取样5～50mL SCDLP培养液中，充分混匀，置35°C±2°C培养18～24h后并观察记录结果。同时设立阳性菌对照、阴性菌对照和阴性对照。

1.2.3 分离

金黄色葡萄球菌：自上述增菌培养液轻轻摇匀，取1～2接种环，将培养物按四区划线分离法划线接种在血琼脂平板及金黄色葡萄球菌显色培养基上，置35°C培养箱培养24h观察菌落特征，金黄色葡萄球菌在显色培养基上生长的菌落特征为：金黄色葡萄球菌菌落为粉红-紫红色菌落；其他菌：蓝绿色或无色或受抑制不生长菌落）。

绿脓杆菌：用灭菌接种环在薄膜处挑取1～2环培养物，按四区划线分离法划线接种十六烷三甲基溴化铵琼脂培养基及假单胞菌属显色培养基上，置35°C培养箱培养24h，观察菌落形态，在假单胞菌属显色培养基上特征如下：假单胞菌属：蓝绿色；大多数肠杆菌：淡紫色且抑制生长；革兰氏阳性菌：抑制）。

1.2.4 菌落纯化

对照上述阳性标准菌株的菌落形态，挑取上述平板中典型可疑的单个菌落，分别纯化在胰酪大豆胨琼脂一次性使用平板上，放置于35°C培养箱进行培养24h。

1.2.5 染色镜检

挑取分纯菌落，涂片，进行革兰氏染色，镜检。

1.2.6 生化鉴定

依据标准采用传统鉴定方法对金黄色葡萄球菌可疑菌落进行生化鉴定：若为革兰氏阳性菌，进行甘露醇发酵试验：每支西林瓶加入35°C培养24h的营养肉汤培养物0.08mL，将已接种的西林瓶再套上胶塞，然后充分混匀，置35°C培养24h后观察结果；血浆凝固酶试验：每支西林瓶加入0.5mL灭菌生理盐水至完全溶解，然后加入葡萄球24h肉汤培养物0.3mL，充分混匀，盖好西林瓶胶塞，置于35°C培养，在6h内观察结果。甘露醇发酵生化试验结果判断如下：甘露醇发酵试验阳性：黄色（产酸）；阴性：紫色（不产酸），依上述操作同时设立阴性对照试验。血浆凝固酶试验阳性：倾斜或倒置试管时，呈现凝固块，或凝固块体积大于原体积的一半时，为血浆凝固酶阳性；阴性：倾斜或倒置试管时无凝块。

依据标准传采用传统方法取上述纯化后的菌落进行革兰氏镜检，并依据《071840绿脓杆菌生化鉴定管使用说明书》检测方法进行生化鉴定。

2.结果

2.1 2020年样品传统鉴定检测结果

2020年共收到4个样品，依据标准采用传统鉴定检测结果见表1。

表1.2020年4个样品依据标准传统鉴定检测结果

2.2 2022年样品传统鉴定检测结果

2022年共收到4个样品，依据标准采用传统鉴定检测结果见表2。

表2.2022年4个样品依据标准传统鉴定检测结果

2.3 全自动检测仪鉴定

由于GTTC-22PT-F28-101样品在假单胞菌属显色平板上有明显的菌落特征，蓝色菌落，所以增加了全自动检测仪进行鉴定，检测结果为恶臭假单胞菌，与传统生化鉴定结果一致，不是绿脓杆菌。

3.讨论

3.1 对于致病菌检测质量控制主要有以下策略及建议

3.1.1 人员培训方面

每年做好科室人员培训计划，对新进人员完成培训上岗，按计划推进人员培训，根据实验室情况制定内部质控计划，定期开展科室内部人员比对实验，人员比对是一种内部质量控制手段之一，通过安排具有代表性的不同层次的两人或者多人开展比对试验，考核检测人员能力水平，判断检测人员操作是否正确、熟练，用以评价人员对实验室检测结果的准确性、稳定性和可靠性的影响，通过室内比对，提高检测人检测能力，为完成室外比对实验打下了基础。

3.1.2 培养基、试剂、标准菌株要严格进行技术性验收

不同公司生产的培养基及生化试剂质量差异较大，因此在检测开始前，实验室应对采购后的培养基、试剂进行有效的技术性验收并做好记录，对标准菌株进行有效的确认试验，以保证检测结果的准确性，以免造成结果假阳性或假阴性。

3.1.3 设施设备方面

为了保证实验结果的准确，实验室应加强检验设备的计量及期间核查，本次实验在生化鉴定方面，除了按标准要求的传统生化鉴定试验外，还增加了细菌鉴定仪对可疑菌落进行生化鉴定，并作为辅助试验，对于这台全自动分析系统实验室每年申请设备厂家进行定期维修保养及较准，具体的项目包括对仪器工作环境、仪器外部状态检测、系统软件及仪器各部件状态检查、操作软件的运作和操作检查等进行维护，使设备能满足检测需要，确保检测结果的准确性，并对该设备的比浊仪进行送检计量。

3.1.4 实验方案的设计

①样品接收状态确认：实验室收到能力验证样品，应认真查看样品外包装是否完整无破损，被检物品状态是否良好，如果有破损情况或标识污损等情况请勿开启样品进行检测，应与主办方联系，重新发样以免影响检测结果的判断。②供试液制备：应根据样品的外包装实际情况及形状规格，设计合适的检验方案，因为能力验证的样品是唯一的，在实验中不能被人为污染，所以设计方案尤为重要，比如这次实验样品是口罩，装在小西林瓶中，依据标准要剪碎置于100mL盐水中振荡，为了防止样品取出来在剪碎过程中掉在实验桌面上，本实验室增加一道工序，先把样品用无菌镊子取出放置于已灭菌的烧杯中再剪碎，从而降低污染率。③实验过程中所用工具均要无菌，所以准备试验的耗材及检测用具要充足，确保实验过程能顺利开展，实验过程严格避免交叉污染。

3.1.5 熟悉标准、严格按标准进行检测

实验人员应熟悉标准，严格按标准进行检测，比如绿脓杆菌在42°C能生长，4°C不生长；这是绿脓杆菌的特性，而且标准明确要做这项检测，不能为了省事减少实验步骤，导致结果出现偏差。

3.1.6 实验人员应掌握检测过程的关键控制点或关键控制环节

①做致病性菌检测时，一定要设阳性菌株及阴性菌株，目的是可以与目标菌的结果进行比较，同时也可以检测耗材的有效性。②菌株分离划线时一定要划出单个菌落，如果第一次分离找不到单个菌落的目标菌，应进行再次分离，直至分离出单个目标菌，再往下操作，否则影响生化鉴定结果。③由于绿脓杆菌是需氧菌，所以在培养基液面会形成有一层薄菌膜，在划线时应挑取菌膜处的培养物划线接种十六烷三甲基溴化铵琼脂上，这点很重要。④氧化酶试验时，一定要用玻棒或一次性灭菌的塑料接种环挑菌轻轻涂抹在试纸上，不能用含铁的用具，防止氧化反应影响检测结果。⑤绿脓菌素试验需要用到氯仿及1N盐酸溶液，生化鉴定盒通常没配有这两种化学试剂，要提前准备好，总之平时要积累经验，努力学习专业知识，提高专业检测水平。

3.2 小结

与以往食品及化妆品微生物能力验证经常采用的冻干粉样品不同的是，2020年及2022年一次性样品致病菌能力验证均采用实物样品的形式，以口罩作为载体，人为添加目标和非目标微生物制成模拟天然样品，与实际检测样品的基质一致，能够完全复现天然样品的全流程检测，对参试实验室进行考核，不仅能考察实验室的检测水平，还能评价其环境设施是否满足标准要求，进而可以全面评价实验室的技术水平和检测能力，本实验室严格按照标准进行操作，增加显色培养基的划线及菌株分离、并用全自动细菌仪对可疑菌落进行生化鉴定辅助检测，传统生化鉴定结果与全自动细菌仪的检测结果一致，并收到组委会满意的检测结果评价，所以证明以上的检测方法及质量控制策略是可行的。目前为止，国家局每年都会对口罩进行抽样检测，仍然发现很多不合格品[9]。据统计，有6.4%检测机购在参加此次能力验证过程中结果评价不满意[10]。希望本文能为企业及同行提供一些检测经验，提高企业对一次性产品的检测能力，助力医疗器械科学监管，提升医疗器械从业人员质量安全意识，保障公众用械安全有效。