基于技术审评的第二类化学发光免疫类体外诊断试剂(盒)相关问题研究

郑秀娥 崔涛 李国勇 杨阳 王玉 郭金双 夏文龙 山东省食品药品审评查验中心 （山东 济南 250014）

内容提要： 针对按第二类医疗器械管理的化学发光免疫类体外诊断试剂（盒）产品，结合国内外免疫自动化检测系统发展现状，以环孢霉素和他克莫司检测试剂盒（化学发光法）为例，从产品技术审评角度，对不同种类化学发光免疫试剂原理进行深入研究，探讨注册申报常见问题，以期对审评员及企业注册申报人员提供思路和帮助。

化学发光免疫类体外诊断试剂（盒）系列产品，作为医疗器械管理的体外诊断（In Vitro Diagnostic，IVD）试剂中发展最为迅速的产品之一，其代表了目前免疫类体外诊断试剂（盒）产品的较高检测水准，在目前免疫分析领域中最具发展潜力。与酶联免疫吸附法和干式荧光免疫层析法类产品相比，化学发光产品的灵敏度、准确度等有一定的优势，并且随着化学发光技术不断地改进、升级，其在各大医院临床检验领域占比份额越来越大，申报此类产品的企业也与日俱增。审评员和注册申报人员深入了解此类产品发展现状、方法原理及申报时常见问题，对于此类产品的科学审评，提高注册申报时限效率等方面不无裨益。

本文依托国家药品监督管理局医疗器械技术审评中心指导原则和山东省药品监督管理局审评研究项目，研究人员实地调研了全国部分持有化学发光免疫类试剂注册证的企业，亲临企业生产现场，与一线研发、注册人员深入探讨产品原理、生产过程及化学发光行业发展现状、产品质量控制的关键点以及注册申报过程中遇到的问题等。

1.化学发光免疫类体外诊断试剂（盒）发展现状

IVD领域是目前医疗器械中占比最大的子领域。2016年，全球IVD市场规模约为562亿美元，占全球医疗器械市场的13%左右，增长率约5%[1]。美国、日本与欧洲为全球最主要的IVD市场，占全球市场的75%左右[2]。跨国公司具有全球垄断地位，罗氏（20%）、雅培（11%）、丹纳赫（11%）和西门子（10%）等前4强占据了全球52%的市场份额。

我国IVD市场发展迅速，市场前景广阔，是全球除欧盟、美国、日本等发达经济体之外的最大单一国家市场。2016年，我国IVD市场规模约600亿元人民币，占全球市场的15%左右，约为全球IVD市场平均增长率的3倍，但我国免疫诊断试剂仅占整个体外诊断试剂市场份额29%[1,3]。化学发光免疫分析产品由于研发难度大，技术门槛高，且国内企业在化学发光免疫分析技术上起步晚于进口厂家，导致我国高端免疫诊断市场90%以上的份额被跨国公司垄断，其产品价格昂贵，医疗费用高，亟需国产化免疫诊断试剂上市充实市场。近年来，医保项目覆盖率的提升导致医疗需求释放，慢性病和传染病发病率居高不下导致诊疗次数增长，人口城镇化比例提升以及人们预防疾病意识提升导致人均诊疗费用上升。基于以上原因，未来中国体外诊断需求预计将以15%～20%的年均增长率增长，成为全球增长最快的市场。

化学发光免疫分析产品基本可以应用于所有的免疫诊断项目，产品包括甲状腺功能检测、肾功能检测、肿瘤标志物检测、传染病检测、激素检测、贫血检测、感染检测、心脏病检测、骨代谢检测、糖尿病检测等诸多疾病的检测试剂，其中肿瘤、甲功、激素、传染病占据了市场80%的份额。近年来，用于药物浓度检测的试剂逐步在市场上出现，例如环孢霉素和他克莫司药物作为常用的免疫抑制剂，主要用于抗器官移植排斥反应，还可应用于治疗某些自身免疫性疾病，定时对患者体内环孢霉素和他克莫司的血药浓度监测，制定个体化给药方案，对提高器官移植的存活率，促进环孢霉素和他克莫司在临床的合理应用具有重要的临床意义[4]。

我国化学发光相关企业约有二百多家，但药物检测类试剂企业不到十家，其分布相对集中，形成了以北京、上海、广东、江苏、浙江为主的产业聚集区。由于国家对行业准入和产品质量要求的提高，化学发光产业新进入者的活跃度降低，新成立的化学发光企业数量在下降，规模小、技术含量低的公司在逐渐退出。目前，国内化学发光免疫分析试剂约有四千七百左右的试剂批件，而药物检测类试剂仅十余个。

综合市场先发性及占有率、化学发光仪器检测准确性和稳定性、检测菜单丰富性和特色优势及渠道布局等因素，目前国产化学发光企业按市场占有份额依次为新产业、安图生物、迈克生物、迈瑞医疗、利德曼、迪瑞医疗、科美生物、长光华医、博奥赛斯、源德生物、科华生物、深圳雷杜等。笔者有幸针对环孢霉素和他克莫司检测试剂指南编制赴深圳新产业开展调研。

2.化学发光免疫分析技术分类及优缺点

化学发光免疫分析是将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合，用于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、脂肪酸、维生素和药物等的检测分析技术。这种方法学包含两个部分，即免疫反应系统和化学发光分析系统。免疫反应系统是将发光物质（在反应剂激发下生成激发态中间体）直接标记在抗原（化学发光免疫分析）或抗体（免疫化学发光分析）上，或酶作用于发光底物。化学发光分析系统是利用化学发光物质经催化剂的催化和氧化剂的氧化，形成一个激发态的中间体，当这种激发态中间体回到稳定的基态时，同时发射出光子，利用发光信号测量仪器测量光量子产额。该技术因具有分析速度快、线性范围宽、无散射光干扰、无放射性污染、仪器设备简单等优势，在临床诊断、生命分析等领域得到广泛应用[5-8]。

2.1 化学发光按照化学反应类型分类

化学发光按照化学反应类型，可分为酶促化学发光和非酶促化学发光。本文以此分类为准介绍代表企业及优缺点，2.2和2.3为不同的分类方式，有部分重合。

2.1.1 酶促化学发光

作为标记物的酶基本不被消耗，而反应体系中发光剂的量充分过量，发光强度稳定，发光时间长，常采用速率法检测。常见的酶促化学发光为碱性磷酸酶（Alkaline Phosphatase，ALP）系统和辣根过氧化物酶（Horseradish Peroxidase，HRP）系统及黄嘌呤氧化酶系统。标记的酶为生物大分子，需要使用长臂双功能团等间接标记技术来解决生物活性保持问题。其测量方式简单（速率法），成本低，灵敏度较高，但工作曲线随时间漂移低端斜率呈非线性下移。

标记物为ALP+螺旋金刚烷环氧化物苯磷酸酯用作标记酶的优点是：稳定性高、灵敏度高；缺点是分子量大（140kD），空间位阻比较大，可能存在内源性ALP的干扰，成本较高。对于化学发光免疫分析来说，ALP的底物比HRP的底物优秀的地方在于ALP为单一组分，基本没有自身发光，持续发光，本底低，信噪比高，灵敏度高、ALP底物稳定性更好。反应动力学没有HRP底物复杂，影响因素少，结果更稳定。但ALP易受黄疸等干扰样本影响，需进行温育反应。主流企业有贝克曼、迈瑞、希森美康等。

标记物为标记HRP+鲁米诺及其衍生物有安图、强生、迈克等，需进行温育反应，可持续发光，也可进行增强发光，易受血红蛋白等干扰样本影响。HRP是免疫诊断试剂产品最常用的标记酶，约占80%。对于化学发光免疫分析来说，HRP的底物的优点是成本低，专利限制少，达到信号峰值快。缺点有鲁米诺在没有HRP存在情况下，也会被H2O2氧化自身发光，本底相对较高，影响信噪比。由于增强剂的存在，反应动力学复杂，影响因素多，结果不够稳定，要得到灵敏度高且平台期长的底物不容易。

2.1.2 非酶促发光

其试剂成本较高、发光时间短，测量方式复杂（积分法），需原位进样，仪器成本及维护费用较高。

吖啶酯：作为标记物的化学物质，氧化反应不需催化剂，发光过程中标记物被消耗，吖啶酯在碱性环境下，直接被过氧化物直接氧化产生发光信号，发光信号持续时间短，信噪比高，为闪光型。优点为标记物为小分子化学物质，对被标记物的构型影响较小，试剂稳定性好，可以两点定标。化学发光体系相对简单，激发液成本低。代表企业为雅培、西门子。

异鲁米诺：直接标记发光物，为闪光型；易受血红蛋白等干扰样本影响，代表企业为新产业、威高、索林。新产业的环孢霉素和他克莫司检测试剂均采用此种方法进行检测。在技术方面主要有两个特点，一是将纳米磁球作为固相载体，二是有机小分子直接化学发光。

电化学发光：氧化反应是通过电极上的电化学反应产生，而不是由氧化剂或者发光剂产生，标记物为三联吡啶钌衍生物即[Ru(bpy)3]2+，并以三乙胺为还原剂。有的为一步法，需要检测池，高压调整需要严格掌控，易受生物素等干扰样本影响，测量方式复杂（脉冲激发、间歇式测量、流动池），仪器成本及维护费用高，环境及样品中同类元素可导致本底干扰。代表企业为罗氏、深圳普门等。

2.2 化学发光按发光持续时间分类

化学发光按发光持续时间分类，可分为辉光型（glow）和闪光型（flash）。

2.2.1 辉光型发光

辉光型的发光时间在数分钟至数十分钟以上，常见酶促发光系统，以速率法测量，即在发光信号相对稳定的区域（坪区）任意点测量单位时间的发光强度。

2.2.2 闪光型发光

闪光型的发光时间在数秒内，如吖啶酯系统，检测方法一般采用原位进样和时间积分法测量，即在检测器模块加装进样器，保证加入发光剂和检测两个步骤同时进行。

2.3 化学发光按检测类型分类

化学发光按检测类型分类，可分为直接化学发光、间接化学发光和电化学发光。

2.3.1 直接化学发光

直接化学发光以化学物质，如异鲁米诺和吖啶酯系列等直接标记抗原或抗体，免疫反应后，直接引发化学发光反应进行检测。

2.3.2 间接化学发光

间接化学发光是用参与发光反应的酶来标记抗原或抗体，免疫反应后，加入发光底物，测定发光系统的发光强度来进行抗原或抗体的检测。

2.3.3 电化学发光

电化学发光是一种在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应。

2.4 化学发光免疫分析方法优势

与以往的放射免疫方法、酶联免疫吸附法相比，化学发光免疫分析方法在灵敏度、线性范围、反应时间、误诊概率方面优势明显，并且很容易实现自动化，进行高通量多样本连续测定。

2.4.1 更高的灵敏度

首先方法本身结合了化学发光检测的高灵敏度和免疫分析的高选择性，加之很多产品含有磁微粒（粒径约1μm）进行放大发光，由于磁微粒的比表面积远远大于酶标板，且磁微粒在反应体系中更接近液相反应，包被的抗原抗体更容易与待测物相结合，使得灵敏度大大提高。

2.4.2 更宽的线性范围

酶免法（酶标仪）的线性范围一般为0.1～3.0 OD（30倍），化学发光法（PMT）的线性范围一般为3×102～3×107RLU（105倍），扩大了线性范围宽度。

2.4.3 更短的反应时间

酶免的总反应时间普遍＞1.5h，加上洗涤和显色时间一般＞2h，化学发光由于抗原抗体反应更接近液相反应，使得反应速率大大加快，大部分项目出结果时间在30min以内。

2.4.4 更小的误诊概率

化学发光体系具有更高的灵敏度和特异性，有效减少灰区；全自动化的仪器操作以减少人为失误和交叉污染带来的误诊；更有效地清洗系统，使非特异吸附较少到最低。

3.新法规下化学发光免疫类体外诊断试剂（盒）相关的产品注册问题

根据《关于公布体外诊断试剂注册申报资料要求和批准证明文件格式的公告（2021年第122号）》要求及化学发光免疫类体外诊断试剂（盒）不同发光方式，以环孢霉素和他克莫司检测试剂盒（化学发光法）为例，结合近一年来山东省注册申报此类产品的发补情况，从技术审评角度对化学发光免疫类体外诊断试剂（盒）的相关问题进行分析，总结出以下几个方面的注意事项。

3.1 产品描述尽量详尽

产品描述中对所采用的技术原理、产品组成等内容应尽量描述详尽。尤其对于技术原理，应包括其反应原理（如双抗体夹心法、竞争法等）、方法学的分类（见上文）、测量方法（终点法还是速率法）、信号处理方法、数据获取和解读方式，分析前处理步骤等。例如，环孢霉素和他克莫司检测试剂盒（化学发光法）采用的是竞争法，异鲁米诺直接标记在抗体上直接引发化学发光反应，发光强度与待测样本中环孢霉素和他克莫司浓度成反比，使用相应的方程拟合可定量测算出样本中环孢霉素和他克莫司浓度。

3.2 生物安全性方面的说明

首先，化学发光免疫类产品不可避免地涉及抗原抗体，至少应对其生物学来源（人、动物、病原体、重组或发酵产物等）和来源地域进行说明。其次，应用蛋白电泳分析等技术证明所用生物材料仅含特征条带，不包含其他。最后，应说明此生物材料密封保存，运输过程中不和人及环境直接接触，或者说明仅在企业参考品中含有，参与生产过程及检验，遵循相关的生产检验操作规程进行操作等。

3.3 产品技术要求对检验方法的特殊要求

《医疗器械产品技术要求编写指导原则》（2022年第8号）中规定产品检验方法应与性能指标相适应，优先选用公认的或已颁布的标准检验方法，同时应具备可操作性和可重现性。除此之外，检验方法中还应当明确说明采用的参考品/标准品、样本制备方法、使用的试剂批次和数量、试验次数、计算方法等内容，其中参考品制备等内容可以附录形式附在产品技术要求正文之后。

3.4 分析性能研究内容及研究报告的要求

分析性能研究是对整个免疫检测系统进行研发阶段性能的总结，是检测仪器、配套试剂、应用软件、分离技术、分离模式、检测技术、抗原/抗体、质控及其他要素综合作用的结果。对于体外诊断试剂来说，除了准确度、精密度、线性范围、灵敏度等基本性能外，如果产品涉及高剂量钩状效应、干扰交叉反应、高浓度的自身抗体或HAMA效应、不同类型样本的一致性比对、样本加样量、抗凝剂影响等其他内容时，也应一并进行研究且提供相应的验证报告，研究结果与产品说明书中相关内容保持一致。可参考《定量检测体外诊断试剂分析性能评估注册审查指导原则》及国际通用的性能评估标准CLSI指南（EP系列文件）进行研究。

对于环孢霉素和他克莫司检测试剂，性能评估时应注意以下两点：一是尽可能纳入预期使用人群（即摄入环孢霉素或他克莫司的患者）的样本进行评价。确需使用加标样本进行研究时，应提供关于药品纯度、代谢产物或潜在干扰物质、样品类型的信息等[4]。二是应考虑药物代谢引入的交叉反应。

分析性能研究的各个项目的报告应包括研究方案。根据报告和数据，提供证据的总结以及证据充分性的论证或者此项研究不适用的说明。仅仅提供研究方法、检测结果数据导致研究资料单薄，不能完整再现企业在研发时所做的工作，另外，审评人员也不能充分了解产品性能全部的研究内容导致发补偏差。

3.5 校准品量值溯源问题

如果申报产品中包含校准品，要保证校准检测系统后测定样品所得结果准确性，必须有量值溯源性，且应当提交溯源资料。校准品是用于修正仪器和试剂产生的偏倚，为使检测结果准确可信，企业必须对校准品进行赋值。赋值结果一般在标签或说明书中给予标识，或以校准曲线的形式录入试剂盒配套校准卡（ID卡、二维码）中。一般企业可以溯源到国际标准物质、参考方法或权威参考系统等。环孢霉素和他克莫司溯源链：终端用户结果→试剂盒内校准品→企业参考品→CRM标准品→美国NIST标准（美国国家标准与技术研究院）可供参考。

另外，在溯源过程中应充分识别每一次量值传递过程中引入的不确定度，确定评估方案，量化不确定度分量，最后来计算合成不确定度和拓展不确定度（参考YY/T 1709-2020《体外诊断试剂用校准物测量不确定度评定》）。还应考虑与校准品有关的校准频率或校准稳定性以及互换性研究。

3.6 参考区间建立时常见问题

根据《体外诊断试剂参考区间确定注册审查指导原则》，需要建立参考区间时，应注意以下问题：一是混淆单、双侧界值。在参考区间建立研究时，应依据临床意义的不同确定检测项目的单侧界值或双侧界值。通常使用双侧2.5%～97.5%的人群分布，单侧时可选择95%或5%。二是数据是否符合正态分布继而导致统计方法不同。在绘制完分布图后宜采用假设检验方法进行综合判断是否符合正态分布。根据是否为正态分布选择合适的方法进行数据离群值判断（Dixon方法适用于非正态分布数据，Tukey法适用于正态分布数据），处理完离群值后，方可进行参考区间建立。如参考值数据近似正态分布或检测数据经变量转换后呈正态分布，可采用正态分布法确定参考区间；如参考值数据呈偏态分布，可采用百分位数法（非参数法）确定参考区间。

由于正常未使用相应药物的人群样本中无可检出的特定药物及其代谢产物，环孢霉素和他克莫司检测试剂盒（化学发光法）等药物检测类试剂不涉及此部分内容，可对相应的治疗范围进行研究并体现在说明书中供临床医生参考。

3.7 临床评价需要注意的情况

如果待评价试剂与比对方法对不同人群亚组表现出不同的性能，或者待评价试剂对不同的人群具有不同的参考区间，则应对不同的人群进行分层统计，做临床试验的产品应纳入符合统计学要求数量的样本，免于临床试验的产品每个人群应分别纳入至少100例样本，如超敏C反应蛋白和常规C反应蛋白、某些激素类产品等。对于药物检测类试剂临床评价入组病例时应充分考虑不同治疗方案（移植物等）、人群选择、地域选择、年龄范围、移植后的时间和抽血时间（谷浓度及其他与给药相关的时间点等）等与给药相关的因素等内容，样本应能够充分评价产品临床使用的安全性、有效性[4]。

4.小结

免疫检测自动化、系统化是技术发展趋势；化学发光免疫类体外诊断试剂（盒）系列产品的检测项目逐步在完善，以期满足临床需求；国内企业在化学发光领域发展迅速，加之国家层面上科研项目支持、政策引导，国产自动化系统前景广阔，国产化学发光免疫类体外诊断试剂（盒）产品也会逐步赶超国际水平，由于药物检测类试剂检测的血药浓度与疗效及毒性密切相关，且血药浓度易被多方面因素影响，随着时间推移，此类产品也会越来越多，以满足临床的需求。

按第二类医疗器械管理的化学发光免疫类体外诊断试剂（盒）产品常见的种类有直接发光法、间接发光法和电化学发光法产品，不同种类的产品有各自的优缺点，应根据检测指标的特性选择相应方法学的产品，才能获得灵敏度和特异度较高的检测结果。在技术审评过程中，应充分考虑产品所采用的原材料、反应原理、分析性能研究相关内容以及校准品溯源情况、参考区间建立过程（如需要）和临床评价确认的结论，结合已经发布的相关国家、行业标准、指导原则、已上市产品的市场应用反馈等，综合评估企业所提交的注册申报资料所呈现的风险。对性能研究、临床评价、产品技术要求和产品说明书应予以重点关注，以提升产品上市后的安全，减少风险隐患。