锌指蛋白382在弥漫大B细胞淋巴瘤组织中的表达及临床意义

刘思哲，安万花，郭淑利，王慧睿，肖蓬莉，王万里，王双琳

(1.新乡医学院,河南 新乡 453003;2.洛阳市中心医院血液科,河南 洛阳 471009)

弥漫大B细胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL)作为成人最常见的侵袭性非霍奇金淋巴瘤,在临床表现、生物学特征及临床预后方面具有高度异质性[1-2]。近年来,随着联合化学治疗及生物靶向治疗的应用,多数患者可获得完全缓解[3];但仍有部分患者出现难治或复发,而难治或复发是导致患者死亡的主要原因[4]。目前,临床常用国际预后指数(international prognostic index,IPI)、经年龄调整的IPI来评估预后和复发风险[5],但该指标仅结合了多项临床因素,而未考虑分子生物学方面的异质性,因而其评估价值有限[6]。因此,深入研究DLBCL的发病机制,探讨新的分子标志物对于DLBCL的精准治疗和预后评估具有重要的临床意义。锌指蛋白382(zinc finger protein 382,ZNF382)是KRAB型锌指蛋白(krüppel-associated box domain-zinc finger protein,KRAB-ZNF)家族的成员之一,定位于19p13.12,编码相对分子质量64 000的锌指蛋白。有研究报道,多种肿瘤的发病过程中均存在ZNF382基因表达异常,该基因可能是一个潜在的新型抑癌基因[7];然而,国内关于ZNF382在DLBCL中的表达情况及其与患者预后的关系报道较少。基于此,本研究旨在观察ZNF382在DLBCL组织样本中的表达,分析其与DLBCL 临床病理特征及预后的关系,探讨其对DLBCL 预后评估的潜在价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2014年1月至2018年12月洛阳市中心医院血液科收治的57例DLBCL患者为研究对象。其中男29例,女28例;年龄30～88岁;原发部位在淋巴结外23例(40.40%),伴B症状(发热、盗汗、体质量减轻)23例(40.40%),伴骨髓浸润(形态学下骨髓中原始+幼稚淋巴细胞≥5%[8])19例(33.30%),伴巨大包块(瘤灶直径≥10 cm)10例(17.50%),乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)水平升高(参考值109～245 U·L-1)41例(71.90%),β2微球蛋白(β2-microglobin,β2-MG)水平升高(参考值1～3 mg·L-1)35例(61.40%),美国东部肿瘤协作组(Eastern Cooperative Oncology Group,ECOG)体能状况评分≥2分者21例(36.80%),Ann Arbor分期为Ⅲ～Ⅳ期者34例(59.60%),IPI评分≥3分者32例(56.10%),Ki67指数>70%者22例(38.60%);Hans分型:生发中心B细胞样淋巴癌(germinal center B-cell-like lymphoma,GCB) 20例(35.10%),非生发中心B细胞样淋巴癌(non-germinal center B-cell-like lymphoma,non-GCB) 37例(64.90%)。本研究获得医院医学伦理委员会审核批准,患者和(或)家属知情同意并签署知情同意书。

1.2 治疗及预后评估

57例DLBCL患者中38例行联合利妥昔单抗化学治疗,其余19例患者化学治疗方案中不含利妥昔单抗,化学治疗疗程6(1～12)个;3例患者行自体造血干细胞移植,1例患者行嵌合抗原受体T细胞治疗。完成2～4个疗程诱导化学治疗后,根据2013年版《中国弥漫大B细胞淋巴瘤诊断与治疗指南》评估治疗效果[9],分为完全缓解(complete response,CR)、部分缓解(partial response,PR)、疾病稳定(stable disease,SD)和疾病进展(progressive disease,PD),CR和PR为有效,SD和PD为无效。依据患者治疗后的生存时间评估长期疗效。

1.3 En vision二步法检测DLBCL 组织和反应性增生淋巴组织中ZNF382表达

二步法免疫组织化学检测试剂盒购自武汉Elabscience公司。取57例DLBCL 患者的肿瘤组织石蜡标本切片和洛阳市中心医院病理科保存的20例反应性增生淋巴组织石蜡标本切片,将石蜡切片放入65 ℃烤箱内40 min,经二甲苯脱蜡、乙醇水化、磷酸盐缓冲液 (phosphate buffered saline,PBS)漂洗后,置于配制好的抗原修复液(0.01 mol·L-1柠檬酸钠缓冲溶液,pH 6.0)中,使用高压锅加热25 min后自然冷却,PBS冲洗3次;应用体积分数3%过氧化氢室温孵育10 min以阻断内源性过氧化物酶,PBS充分冲洗3次;滴加体积分数5%即用型正常山羊血清,室温封闭30 min,PBS充分冲洗3次;滴加兔抗人ZNF382多克隆抗体(滴度为180,购自美国Sigma-Aldrich公司),4 ℃孵育过夜,次日复温(37 ℃水浴锅复温5～10 min)后,滴加聚合物辅助剂室温孵育20 min,PBS充分冲洗3次;滴加羊抗兔IgG二抗,室温孵育60 min,PBS充分冲洗3次;然后用二氨基联苯胺显色液覆盖组织1 min,显微镜下观察显色后用蒸馏水清洗终止显色,苏木精染色法复染细胞核,盐酸乙醇分化、氨水返蓝,最后使用中性树胶封片。常规PBS代替一抗作为阴性对照,使用小鼠心脏组织切片作为阳性对照。每张免疫组织化学切片在显微镜下放大400倍后随机取8个视野,应用Image-pro plus 6.0软件进行图像分析,计算切片中各视野阳性点总面积及累积吸光度值,以半定量法计算平均光密度(optical density,OD)值,以OD值表示ZNF382表达水平,OD值越大代表ZNF382表达水平越高[10]。

1.4 随访

对57例DLBCL患者进行生存随访,随访方式包括门诊随访和电话随访,截至2020年4月30日。无事件生存(event-free survival,EFS)期为主要终点指标。EFS为确诊到发生事件(死亡、首次PD、首次复发、首次更换二线治疗方案)或末次随访之间的时间。若患者在末次随访时仍然存活且未发生过PD、复发、更换方案等事件,则计为删失值。

1.5 统计学处理

应用SPSS 22.0软件进行统计学分析。正态性检验采用Shapiro-Wilk方法,不符合正态分布的连续变量资料以中位数(四分位数)表示,2组间比较采用Mann-WhitneyU检验;采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线;对可能影响EFS的预后因素采用log-rank 法行单因素分析,并对其中P<0.05的因素行Cox比例风险模型多因素分析;P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 DLBCL肿瘤组织与反应性增生淋巴结组织中ZNF382表达水平比较

ZNF382主要定位于细胞质中,偶见细胞核中,肿瘤旁间质无表达,反应性增生淋巴结组织中ZNF382表达显著多于DLBCL组织(图1)。DLBCL组织中ZNF382表达水平为0.021 1(0.006 9,0.060 9),反应性增生淋巴结组织中ZNF382表达水平为0.123 6(0.084 2,0.188 9)(OD值);DLBCL组织中ZNF382表达水平显著低于反应性增生淋巴结组织,差异有统计学意义(Z=-5.056,P<0.01)。

A:反应性增生淋巴结组织中ZNF382表达(×200);B:DLBCL组织中ZNF382蛋白表达(×200);C:反应性增生淋巴结组织中ZNF382表达(×400);D:DLBCL组织中ZNF382蛋白表达(×400)。

2.2 ZNF382表达水平与DLBCL患者临床病理特征的关系

ZNF382表达水平与DLBCL患者的IPI评分、Ann Arbor分期、Hans分型、B症状、骨髓浸润、巨大包块相关(P<0.05);ZNF382表达水平与DLBCL患者的性别、年龄、原发部位、ECOG评分、β2-MG、血清LDH、Ki67、是否联合妥昔单抗化学治疗无关(P>0.05)。结果见表1。

表1 不同临床病理特征DLBCL患者肿瘤组织中ZNF382表达水平比较Tab.1 Comparison of ZNF382 expression levels in tumor tissues of DLBCL patients with different clinical and pathological characteristics

2.3 治疗有效与治疗无效DLBCL患者肿瘤组织中ZNF382表达水平比较

57例患者中治疗有效者36例(63.20%),无效者21例(36.80%)。治疗有效患者和治疗无效患者肿瘤组织中ZNF382表达水平分别为0.031 2(0.017 8,0.074 3)、0.007 1(0.003 5,0.031 4);治疗有效患者肿瘤组织中ZNF382表达水平显著高于治疗无效患者,差异有统计学意义(Z=-2.895,P<0.01)。

2.4 ZNF382表达对DLBCL患者预后的影响

57例患者中有54例完成生存随访,3例失访,失访率为5.26%,中位随访时间为26(6～63)个月。在随访时间内,共观察到31例事件,包括15例PD、4例复发、9例更换二线治疗方案以及3例因肿瘤及其治疗相关的死亡。以OD值的P50(第50位百分位数)为截断值,将DLBCL患者分为ZNF382高表达组(OD值>0.021 1)和低表达组(OD值≤0.021 1)。生存分析结果显示,ZNF382高表达组和ZNF382低表达组患者的2 a EFS率分别为59.4%[95%置信区间(confidence interval,CI)38.0%～80.8%]、18.3%(95%CI:2.4%～34.2%);ZNF382高表达组患者2 a EFS率显著高于ZNF382低表达组,差异有统计学意义(χ2=17.955,P<0.001);结果见图2。

图2 ZNF382高表达组和低表达组DLBCL患者的无事件生存曲线Fig.2 Event free survival curves of DLBCL patients in the ZNF382 high expression group and ZNF382 low expression group

2.5 DLBCL患者预后影响因素的单因素、多因素分析

单因素分析结果显示,女性、淋巴结内原发、有B症状、有骨髓浸润、有巨大包块、IPI评分≥3分、β2-MG升高、Ki67>70%、non-GCB型、Ann Arbor分期 Ⅲ～Ⅳ期、ZNF382低表达是影响DLBCL患者预后的危险因素[风险比(hazard ratio,HR)=2.134、2.184、2.664、3.301、4.112、2.425、2.383、2.199、5.231、0.291,P<0.05];多因素分析结果显示,淋巴结内原发、Ann Arbor分期 Ⅲ～Ⅳ期、ZNF382低表达是DLBCL患者预后不良(疾病进展、死亡)的独立危险因素(HR=6.248、7.253、0.208,P<0.05)。结果见表2。

表2 DLBCL患者预后影响因素的单因素和多因素分析Tab.2 Univariate and multivariate analysis on influencing factor of prognosis of DLBCL patients

3 讨论

DLBCL的发生、发展是一个涉及多基因、多因素、多阶段的病理过程。在标准的CHOP(环磷酰胺、阿霉素类、长春新碱和泼尼松)方案上加入利妥昔单抗后可使患者的总生存率提高10%～15%[11];多数DLBCL患者经CHOP联合利妥昔单抗治疗后预后良好,但仍有部分患者会出现病情进展或复发[12-13]。有研究指出,肿瘤细胞高增殖性及侵袭性是影响患者治疗效果及导致复发的主要因素[14]。因此,深入研究DLBCL的发病机制,探讨新的分子标志物对于DLBCL的精准治疗和预后评估具有重要的临床意义。KRAB-ZFP最早于1983年在爪蟾卵母细胞的转录因子ⅢA中被发现,是机体最常见的一类转录因子[15];KRAB-ZFP参与转录调控人类约2%的基因,有近800个成员[16-18]。ZNF382是KRAB-ZFP家族成员,由典型的C2H2锌指结构域和Krüppel相关盒结构域组成[19],通过C2H2锌指结构域的定位和KRAB结构域的抑制,ZNF382可作用于核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)和激活子蛋白-1信号通路,从而对NF-κB信号通路上游因子信号转导和转录活化因子(signal transducer and activator of transcription,STAT) 3、STAT5B、分化抑制因子1和NF-κB抑制蛋白E抗体等多种癌基因的表达起到负性调控作用[20]。既往研究显示,ZNF382参与细胞增殖、分化、侵袭、凋亡和肿瘤转化等诸多进程[21-23],在胃癌、食管鳞状细胞癌、肝癌等多种实体瘤中表达下调或沉默[23-25]。为此,本研究选择临床确诊为DLBCL患者的淋巴结病理组织样本,并以反应性增生的淋巴结组织作为对照,观察ZNF382在DLBCL中的表达及其与预后的关系。

本研究结果显示,DLBCL组织中ZNF382表达水平显著低于反应性增生淋巴结组织,说明ZNF382在DLBCL患者的肿瘤组织中呈低表达,ZNF382在DLBCL的发生发展中发挥了一定作用,这与该基因在其他肿瘤中的研究结果相一致[23-26]。本研究结果显示,ZNF382表达水平与DLBCL患者的IPI评分、Ann Arbor分期、Hans分型、B症状、骨髓浸润、巨大包块相关,治疗有效患者肿瘤组织中ZNF382表达水平显著高于治疗无效患者;这进一步证实,ZNF382作为一个新的抑癌基因在DLBCL的发生发展中发挥作用,ZNF382表达水平影响 DLBCL的治疗效果,其可作为预测临床疗效的标志物。同时,本研究结果显示,ZNF382高表达组患者的2 a EFS率显著高于ZNF382低表达组,提示ZNF382表达水平影响DLBCL患者治疗后的生存时间,其可作为预测DLBCL患者治疗后生存时间的生物学指标。此外,本研究单因素分析显示,女性、淋巴结内原发、有B症状、有骨髓浸润、有巨大包块、IPI评分≥3分、β2-MG升高、Ki67>70%、non-GCB型、Ann Arbor分期Ⅲ～Ⅳ期、ZNF382低表达为影响DLBCL患者预后的危险因素,说明DLBCL的发生发展是多种因素参与的复杂病理过程,ZNF382表达水平影响DLBCL患者的预后。本研究多因素分析结果显示,淋巴结内原发、Ann Arbor分期Ⅲ～Ⅳ期、ZNF382低表达是影响DLBCL患者预后的独立危险因素,提示ZNF382可作为DLBCL患者预后监测的有效指标。

4 结论

ZNF382在不同临床分期和预后的DLBCL患者肿瘤组织中表达存在差异,其表达量的高低可作为对DLBCL预后监测的有效指标。但本研究为单中心、回顾性分析,临床资料收集过程可能存在信息偏倚;另外,本研究样本量较少,结果可能存在偏差;未来应运用更加先进的技术及方法,进行前瞻性、大样本多中心临床研究、细胞分子研究等,进一步明确ZNF382在DLBCL中的具体作用机制,以期为 DLBCL 患者的治疗提供新的理论依据和治疗靶点。