微RNA-124-3p在溃疡性结肠炎病人外周血中的表达及意义

吴春燕，汪晓燕，李炎

作者单位：武汉市蔡甸区人民医院，a消化内科，b内分泌科，湖北 武汉430100

目前为止，溃疡性结肠炎（UC）确切的发病机制尚不清楚［1-2］。因此，早期诊断UC疾病及其严重程度对及时有效地进行治疗至关重要［3］。微RNA（miRNA）是一种长度为18～25个核苷酸的单链非编码内源性RNA 分子，其主要功能是负调控编码蛋白靶基因的mRNA稳定性，不仅影响癌症的发生发展，而且在其他疾病的进展中也具有一些特殊的调控功能［4］。近年来证据表明，miRNA 在UC 中广泛失调，可能参与UC 的发病机制，并在其诊断和治疗方面发挥作用［5-6］。微RNA-124（miR-124）最初在小鼠中发现，后来被证明是一个高度保守的miRNA。微RNA-124-3p（miR-124-3p）是miR124 成员之一，位于染色体20q13.33，此前主要被表述为一个肿瘤抑制因子，随后发现其在免疫功能调节中发挥作用，并参与调节各种炎症反应［7］。miR-124-3p 的研究主要集中在癌症发生与发展中的潜在影响方面，而对于UC的临床研究了解较少。因此，本研究检测了miR-124-3p 在UC病人外周血中的表达，旨在阐述miR-124-3p表达在UC 方面的临床意义，为进一步理解UC 发病机制和开发新的治疗手段开辟了一个新的方向。

1 资料与方法

1.1 一般资料本研究为前瞻性研究，选择121 例UC病人（UC组）和60例健康体检者（对照组）作为研究对象。UC 组来源于2019 年8 月至2021 年8 月武汉市蔡甸区人民医院消化科住院治疗的病人，其中男性63例，女性58例；年龄范围为20～78岁，中位年龄40岁；病情缓解期43例，活动期78例；病变为直肠的30例，左半结肠36例，广泛结肠55例。所有UC病人均进行了临床常规检查、结肠镜检查及组织病理学评估，符合《炎症性肠病诊断与治疗的共识意见（2018年·北京）》［8］中的诊断标准，就诊前未接受过其他治疗，临床资料完善；排除合并其他炎性疾病和恶性肿瘤的病人及有肝肾功能障碍的病人。对照组来源于同期于我院进行健康体检的个体，男性35例，女性25例，年龄范围为27～76岁。两组病人性别、年龄相比，均差异无统计学意义（χ2=0.64，P=0.426；t=1.15，P=0.253）。病人或其近亲属知情同意，本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求。

1.2 方法

1.2.1 外周血单个核细胞分离及总RNA 提取 抽取所有研究对象清晨空腹状态下的静脉血5 mL，收集在肝素抗凝管中，使用淋巴细胞分离液分离纯化外周血单个核细胞，保存待测。使用TRIzol试剂（赛默飞世尔科技有限公司，货号10296028）按照说明书的步骤提取UC 病人和健康体检者外周血单个核细胞中的总RNA，RNA 样品的浓度和纯度使用电泳和分光光度法测定，OD值1.8～2.0为合格。

1.2.2 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测miR-124-3p 表达水平 取检测合格的RNA 样品，使用miScript 逆转录试剂盒（上海联硕宝为生物科技有限公司，货号218161）进行cDNA 制备，然后使用miScript SYBR Green PCR Kit（上海宾智生物科技有限公司，货号218075）在ABI 7900HT 荧光定量PCR系统上（美国ABI 公司）检测miR-124-3p 的表达水平。qRT-PCR 反应条件为95 ℃预变性5 min，95 ℃变性10 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸10 s，共40 个循环。以U6 作为内参基因，引物序列如下：miR-124-3p 正 向5"-CGGGTAGCAGGCTTCTGAGT-3"，miR-124-3p 反 向5"-AAACCCCTCTCTGTCGGTAGCT-3"；U6 正 向5"-CTTTGCCGCACGGCACA-3"，U6 反向5"-GTGCAGGGTCCGAGGTATTC-3"，引物干粉由上海生工生物公司合成。每组实验重复3 次，最后使用2-ΔΔCt公式计算miR-124-3p的表达水平。

1.2.3 C-反应蛋白（CRP）水平检测 CRP 水平检测使用酶联免疫吸附实验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法，严格按照试剂盒（北京，货号SEKH-0138）说明书的操作方法进行检测。

1.2.4 UC病人严重程度分组 根据UC内镜严重指数（UCEIS）对UC 病人受累肠段严重程度进行评分［9］，根据血管纹理、出血情况及糜烂溃疡这3 个方面计算UCEIS 评分，血管正常为0分，血管纹理部分消失为1分，全部消失为2分；无出血为0分，黏膜出血为1分，腔内少量新鲜出血为2分，腔内多量出血，冲洗后渗血，黏膜新鲜渗血为3分；正常黏膜，无溃疡为0 分，糜烂（黏膜表面黄白色平坦边缘≤5 mm 小缺损）为1 分，浅溃疡（＞5 mm 黏膜破损，或散在表浅溃疡）为2分，深溃疡（深凿样黏膜缺损，周边轻度隆起）为3分。UC缓解期病人UCEIS评分为0～1分，活动期为2～8 分。根据改良梅奥（Mayo）评分对UC 病人临床活动度进行评价［10］，症状缓解及轻度、中度、重度活动分别为0～2分、3～5分、6～10分、11～12分。

1.3 统计学方法本研究数据应用SPSS 22.0版本统计学软件完成分析。计量资料用±s表示，两组间比较采用t检验，三组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK-q检验；UC活动期病人外周血miR-124-3p表达水平与CRP水平的相关性采用Pearson法，与UCEIS 评分、改良Mayo 评分的相关性分析采用Spearman法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-124-3p 及CRP 在UC 组和对照组外周血中的表达水平与对照组相比，UC组病人外周血中miR-124-3p 的表达水平显著降低（P＜0.05），CRP 水平显著升高（P＜0.05）。见表1。

表1 溃疡性结肠炎（UC）病人121例和健康体检者60例miR-124-3p、CRP表达水平的比较∕ ± s

表1 溃疡性结肠炎（UC）病人121例和健康体检者60例miR-124-3p、CRP表达水平的比较∕ ± s

注：miR-124-3p为微RNA-124-3p，CRP为C-反应蛋白。

组别对照组UC组t值P值CRP∕（mg∕L）7.08±2.52 9.83±2.91 6.25＜0.001例数60 121 miR-124-3p 0.84±0.22 0.52±0.17 10.78＜0.001

2.2 miR-124-3p 及CRP 在UC 缓解期和活动期病人外周血中的表达水平与UC缓解期病人相比，活动期病人外周血中miR-124-3p的表达水平显著降低（P＜0.05），CRP水平显著升高（P＜0.05）。见表2。

表2 溃疡性结肠炎（UC）病人121例缓解期和活动期miR-124-3p、CRP表达水平的比较∕ ± s

表2 溃疡性结肠炎（UC）病人121例缓解期和活动期miR-124-3p、CRP表达水平的比较∕ ± s

注：miR-124-3p为微RNA-124-3p，CRP为C-反应蛋白。

病情程度缓解期活动期t值P值CRP∕（mg∕L）9.06±2.85 10.25±2.94 2.15 0.033例数43 78 miR-124-3p 0.67±0.22 0.44±0.14 7.02＜0.001

2.3 miR-124-3p 及CRP 在UC 不同病变范围病人外周血中的表达水平UC 不同病变范围病人miR-124-3p、CRP 表达水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

表3 溃疡性结肠炎（UC）病人121例不同病变范围miR-124-3p、CRP表达水平的比较∕ ± s

表3 溃疡性结肠炎（UC）病人121例不同病变范围miR-124-3p、CRP表达水平的比较∕ ± s

注：miR-124-3p为微RNA-124-3p，CRP为C-反应蛋白。

病变范围直肠左半结肠广泛结肠F值P值CRP∕（mg∕L）10.85±3.08 9.24±2.63 9.65±2.99 2.69 0.072例数30 36 55 miR-124-3p 0.46±0.14 0.52±0.17 0.55±0.18 2.79 0.066

2.4 UC 不同临床活动度病人外周血miR-124-3p、CRP 表达水平及UCEIS 评分、改良Mayo 评分的比较与UC 轻度活动病人相比，中度和重度活动病人外周血中miR-124-3p 的表达水平显著降低（P＜0.05），CRP 水平、UCEIS 评分及改良Mayo 评分显著升高（P＜0.05）；与UC 中度活动病人相比，重度活动病人外周血中miR-124-3p 的表达水平显著降低（P＜0.05），CRP 水平、UCEIS 评分及改良Mayo 评分显著升高（P＜0.05）。见表4。

表4 溃疡性结肠炎（UC）不同活动期78例miR-124-3p、CRP表达水平及UCEIS评分、改良Mayo评分的比较∕ ± s

表4 溃疡性结肠炎（UC）不同活动期78例miR-124-3p、CRP表达水平及UCEIS评分、改良Mayo评分的比较∕ ± s

注：miR-124-3p为微RNA-124-3p，CRP为C-反应蛋白，UCEIS评分为溃疡性结肠炎内镜严重指数评分，改良Mayo评分为改良梅奥评分。①与轻度相比，P＜0.05。②与中度相比，P＜0.05。

临床活动度轻度中度重度F值P值改良Mayo评分∕分3.98±0.95 7.70±1.64①11.53±0.46①②240.04＜0.001例数27 30 21 miR-124-3p 0.53±0.16 0.45±0.13①0.30±0.09①②16.01＜0.001 CRP∕（mg∕L）8.74±2.83 10.35±2.79①12.03±3.02①②7.43 0.001 UCEIS评分∕分3.03±0.90 4.82±1.51①5.97±1.82①②26.10＜0.001

2.5 UC 活动期病人外周血miR-124-3p 与CRP、UCEIS评分及改良Mayo评分的相关性相关性分析结果显示，UC活动期78例外周血miR-124-3p表达水平与CRP、UCEIS评分及改良Mayo评分均呈负相关（r=-0.57，P＜0.05；r=-0.44，P＜0.05；r=-0.59，P＜0.05）。

3 讨论

在过去的20 年里，对UC 复杂发病机制的更多了解引发了药物开发的进步，如几种生物制剂和小分子疗法的开发，尽管治疗选择的增加是积极的，但对临床UC 的疗效有限，一旦确诊难以治愈，并且与结直肠癌的高风险相关［11］。目前仍需要寻找UC潜在的治疗靶点，以利于临床早期评估病情严重程度，确定有效的治疗方式。

先前的研究已经证明miRNA 在UC 病人中差异表达，并且在UC 的病理过程中具有重要作用。例如，miR-155 改善UC 病人的活动期肠道炎症，miR-21 可缓解UC 肠道屏障功能受损［12］。UC 是一个严重的炎症过程，不同的miRNA 在UC 的炎症过程中发挥着不同的调节作用。miR-206 在UC 中的表达量显著上调，在炎症反应调节中发挥促炎因子的作用［13］。miR-505在UC中的表达量下调，其低表达与病人的病情严重程度和预后不良有关［14］。miR-219-5p在UC 小鼠结肠黏膜组织中下调，注射其慢病毒过表达载体可抑制促炎细胞因子的产生，减轻UC 小鼠的结肠损伤［15］。越来越多的证据表明，miR-124-3p 的表达异常与各种类型癌症的恶性进展、耐药甚至预后生存相关，对于某些疾病的早期诊断、治疗和预后有重要价值［5］。前人关于miR-124-3p的研究主要集中在癌症领域，例如，Wang 等［16］报道了miR-124-3p 在肝细胞癌中表达下调，与肝细胞癌的进展和转移密切相关。而最近几年研究表明，miR-124-3p 在免疫功能中发挥作用，并参与调节各种炎症反应。Liang 等［17］在心肌缺血再灌注损伤的大鼠模型和H∕R 处理的人心肌细胞中发现miR-124-3p 显著下调，可能调节H∕R 诱导的炎症和细胞凋亡。Luo等［18］的研究中报道了miR-124-3p 与UC 相关，miR-124-3p 通过靶向调控LPS 诱导的结肠细胞中的STAT3 发挥作用，增强miR-124-3p 的表达可减少炎症过程中细胞凋亡和ROS 的产生。基于以上文献，我们的研究检测了UC 病人和对照组外周血miR-124-3p的表达水平，研究显示，与对照组相比，UC病人中miR-124-3p 的表达水平显著降低，说明miR-124-3p 表达水平可能对UC 的发生过程产生一定的影响。

本研究中，UC 活动期病人外周血miR-124-3p表达水平较缓解期低，且UC 不同临床活动度病人外周血miR-124-3p 表达水平由高至低依次为轻度、中度、重度，说明miR-124-3p 表达水平可能与UC 病人病情变化有关。大量研究证实，UCEIS评分、改良Mayo 评分是临床常用评估UC 严重程度的工具，而CRP 是一种临床常用的炎症标志物，在各种其他疾病状态下均可迅速升高，对于评估UC 病情严重程度具有较高的灵敏度，在预测是否需要结肠切除术方面具有重要作用。对于UC 病人来说，UCEIS 评分、改良Mayo评分和CRP水平在总体严重程度评分中拥有较高的权重［19-20］。本研究中CRP 水平在UC病人中水平升高，UC 活动期病人CRP 水平较缓解期高，UC 不同临床活动度病人CRP 表达水平及UCEIS 评分、改良Mayo 评分由高至低依次为重度、中度、轻度，且相关分析结果显示UC 活动期病人外周血miR-124-3p 表达水平与CRP、UCEIS 评分及改良Mayo评分均呈负相关，进一步说明miR-124-3p表达可能与UC 病变活动和严重程度有一定关系，且可能参与UC 的炎症反应。此外，本研究通过分析UC 不同病变范围病人miR-124-3p、CRP 表达水平，结果显示miR-124-3p、CRP表达在UC不同病变范围中的变化较小，提示检测miR-124-3p、CRP水平对区分UC的发病部位帮助较小。

综上所述，UC 病人外周血miR-124-3p 表达水平较低，miR-124-3p 表达水平与UC 病人CRP、UCEIS 评分及改良Mayo 评分密切相关，可能成为反映UC 病人病情的指标之一。但本研究存在一些局限性，样本规模相对较小，使得在数据选择和分析中容易产生偏倚，需要进一步加大规模验证。