基于网络药理学及分子对接探讨枳实-杏仁药对治疗便秘的作用机制Δ

孟令昀,肖长芳,胡 濛,孙飏炀,王群博,姚一博

(上海中医药大学附属龙华医院肛肠科,上海 200032)

便秘属于消化道疾病,主要表现为排便吃力、大便量少和便后留有不尽感[1]。在治疗方法上,临床多采用改善生活方式、生物反馈、药物治疗和手术处理等措施进行干预[2]。从便秘治疗的长期随访中发现,这些治疗措施存在疗效欠佳、症状易反复等问题[3-4]。中医在便秘的治疗中独具特色,认为肺脾与便秘的发生密切相关,肺气下布,促进肠道蠕动;脾胃调节全身气机,调控肠道顺利传导糟粕[5-6]。中医在便秘的治疗中遵循整体与局部相调控,在经方药对的应用上尤其具有代表性。麻子仁丸中,杏仁为臣,上肃肺气,下润大肠;枳实为佐使,下气破结,使通便之力增强[7]。大五柔丸中,枳实为臣,降气行滞;杏仁为佐使,导气下行[8]。在枳实-杏仁药对中,枳实调畅气机,除胀消满;杏仁宣肺降气,润肠通便;两者配合,行气润肠,共奏通便之效。但目前对于枳实-杏仁药对治疗便秘的作用机制缺少一定的研究,网络药理学及分子对接技术依据药物活性成分与疾病靶点的关联性及结合亲密度,预测药物治疗疾病的作用机制,可为分析枳实-杏仁药对治疗便秘的作用机制提供新的思路[9-10]。

1 资料与方法

1.1 枳实-杏仁药对活性成分及对应靶点的筛选

以口服生物利用度(OB)为标准选择吸收代谢程度较好的中药成分,以类药性(DL)为要求筛选对人体较安全的中药成分。在中药系统药理学数据库与分析平台(http：//tcmspw.com/tcmsp. org/)中设置上述参数,筛选枳实-杏仁药对中有利吸收且不良反应小的活性成分及靶点;利用Uniprot数据库(http：//www.uniprot.org/)找到对应的标准基因名称。

1.2 便秘疾病靶点及枳实-杏仁药对与便秘共有靶点的收集整理

在DrugBank、GeneCards、治疗靶点数据库(TTD)、PharmGKB和人类孟德尔遗传综合数据库(OMIM)中收集便秘靶点,然后与药对作用靶点进行交互,得到药对与便秘的共有靶点。

1.3 枳实-杏仁药对主要有效成分的筛选

将枳实-杏仁药对的活性成分及枳实-杏仁药对与便秘共有靶点导入Cytoscape,形成枳实-杏仁药对活性成分与共有靶点的网络可视化分析图,计算Degree值,搜寻药对中可治疗便秘的主要有效成分。

1.4 蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)

便秘靶点PPI详情通过STRING version 11.5 数据库平台获得(http：//string-db.org/),然后导入Cytoscape软件,利用拓扑分析构建PPI网络分析图,得到核心共有靶点。

1.5 基因和通路富集分析

运用R 4.1.1软件对共有靶点进行基因本体(GO)功能富集分析,可得到药对调控便秘的主要生物学过程;进行京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析,可找到药对调控便秘的核心信号通路。

1.6 分子对接验证

通过PubChem、ChemOffice 14.0.0.117生成小分子配体结构;通过PDB选择大分子受体结构;应用AutoDockTools 1.5.7处理配受体分子;应用Vina 1.1.2 计算配受体对接的结合能。

2 结果

2.1 枳实-杏仁药对的活性成分及对应靶点

按照OB≥30%、DL≥0.18的要求,枳实共有22个活性成分,杏仁共有19个活性成分,共41个活性成分,见表1。活性成分对应的靶点经合并后共82个。

2.2 便秘疾病靶点及枳实-杏仁药对与便秘共有靶点的汇总

从GeneCards数据库得到1 117个便秘靶点,从OMIM数据库得到200个便秘靶点,从PharmGkb数据库得到410个便秘靶点,从TTD数据库得到11个便秘靶点,从DrugBank数据库得到100个便秘靶点,去重后剩余1 526个便秘靶点。枳实-杏仁药对对应靶点与便秘作用靶点相互匹配后,最后取得60个共有靶点。

2.3 枳实-杏仁有效成分与共有靶点关系图

成分-靶点关系图中,左边蓝色长方形内编号代表33个药对有效成分,右边蓝色长方形内编号代表60个疾病共有靶点。左边有效成分上连接的直线越多,代表该有效成分越与疾病相关;右边疾病共有靶点的蓝色面积越大,代表该靶点越与疾病相关;通过网络关系图可进一步突出主要有效成分和核心共有靶点,见图1。Degree值排序居前15位的有效成分见表2。

2.4 PPI网络的绘制与筛选

将共有靶点按数据库要求规范整理好格式后再导入STRING系统,设置系统参数、剔除部分靶点后,得到枳实-杏仁药对治疗便秘的PPI网络,见图2。最后将筛选好的PPI信息导入Cytoscape,利用软件中CytoHub插件计算节点的Degree、LAC和Network等值,标准为>中位值,使用R语言得出核心共有靶点网络图,见图3。

图2 枳实-杏仁药对治疗便秘的PPI网络Fig 2 PPI network of fructus aurantii immaturus-almond in treatment of consipation

图3 核心PPI网络图Fig 3 Core PPI network diagram

图4 GO分析Fig 4 GO analysis

图5 KEGG分析Fig 5 KEGG analysis

2.5 基因和通路富集分析

将枳实-杏仁药对治疗便秘的60个共有靶点进行GO富集分析,生物学过程包括衰老、平滑肌细胞增殖等;细胞组成包括局灶性粘连、细胞体等;分子功能包括钙调素结合、儿茶酚胺结合等,见图4。KEGG富集分析确定了磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B(PI3K-Akt)、雌激素受体等信号通路,见图5。

2.6 有效成分与共有靶点对接

通过AutoDock-Vina软件将主要有效成分木犀草素、甘草酚与核心共有靶点丝裂原激活的蛋白激酶1(MAPK1)、糖原合酶激酶3β(GSK-3β)进行分子对接,结果显示,木犀草素与MAPK1的结合能为-36.0 kJ/mol,甘草酚与GSK-3β的结合能为-40.6 kJ/mol。使用Pymol软件直观展现枳实-杏仁药对有效成分与便秘疾病核心靶点的结合形式,见图6。

A.MAPK1(1TV0)-木犀草素;B.GSK-3β(1J1B)-甘草酚。A.MAPK1(1TV0)-luteolin; B.GSK-3β(1J1B)-glycyrol.图6 关键蛋白 MAPK1、GSK-3β与主要小分子的对接模式图Fig 6 Molecular docking pattern of key proteins MAPK1 and GSK-3β with major small molecule

3 讨论

药对是方剂配伍的基本形式,与其他配伍相辅相成,在临床发挥重要功效。枳实-杏仁是便秘经方中的经典药对之一。上海市名中医陆金根教授认为,在肺气不宣型便秘中,枳实可消积化滞通便[11]。李敏等[12]认为,枳实可破气化滞,从而减轻便秘腹胀的困扰。杏仁润肠滑便作用显著,可缓解肠燥便秘[13]。陆金根教授在腑气不通型便秘中,采用杏仁,发挥其辛能行气、苦能降气的功效[11]。枳实-杏仁药对调脾胃而理气机,降肺气而润肠道,共行通便之效。但是,对于枳实-杏仁药对治疗便秘的作用机制缺乏相关的研究。

本研究中,枳实-杏仁药对共筛选出有效成分33个,便秘的治疗靶点60个。有效成分主要为木犀草素、甘草酚。木犀草素可通过调节小鼠L型钙通道改善结肠平滑肌运动[14]。文献报道,在便秘的肠道组织中发现了炎症因子上调现象,提示抗炎可解决部分便秘问题[15]。甘草酚具有提高肠道微生物多样性、抑制促炎因子表达的作用[16-17]。MAPK1、GSK-3β为治疗便秘的关键靶点。增加MAPK1磷酸化水平,有利于胆碱能神经元的分化,从而增强胃肠道运动[18]。GSK-3β磷酸化水平的高表达可以保护平滑肌线粒体,降低肠细胞损伤,促进慢性肠道炎症消散[19-20]。

GO功能富集结果显示,枳实-杏仁治疗便秘包括调节衰老、肌动蛋白细胞骨架等生物学过程。衰老可能影响肠道激素分泌及肠蠕动,出现便秘症状[21-22]。枳实可通过黄酮类药物成分兴奋肠道平滑肌,增加老年便秘患者胃肠道的规律收缩,进而改善便秘问题[23-24]。杏仁可提高细胞因子、激酶受体表达,调控肌电信号传递,保证平滑肌收驰有度,以此缓解老年便秘[25-26]。枳实、杏仁水提物可以改善结肠平滑肌细胞萎缩、排列紊乱等问题,保证肠组织正常结构,进而缓解便秘[27-28]。KEGG通路富集结果显示,枳实-杏仁药对可能通过调控PI3K-Akt、雌激素受体等信号通路改善便秘。电针刺激或中药水煎剂灌胃刺激PI3K-Akt蛋白传导通路后,增加了结肠组织中PI3K、Akt基因及蛋白表达,进而治疗便秘[29-30]。雌激素受体通路被阻断后,Cajal间质细胞(ICC)会明显减少,从而使便秘加重[31]。文献报道,女性便秘患者结肠运转速度会发生周期性的改变,上调雌激素受体表达可明显改善患者慢传输型便秘[32]。枳实可在一定程度抑制PI3K-Akt通路,减轻ICC自噬,从而改善便秘[33]。

综上所述,枳实-杏仁药对中的木犀草素、甘草酚等活性成分作用于便秘疾病MAPK1、GSK-3β等靶点蛋白,并通过干预PI3K-Akt、雌激素信号等信号通路,以丰富肠道微生物种类、修复肠道屏障、抑制炎症发生、调节钙离子通道和维持电信号传导等方式达到缓解便秘的目的。本研究为进一步探讨枳实-杏仁药对治疗便秘提供了理论参考。