线粒体DNA拷贝数作为生物标志物的研究前景

徐冬旸, 刁勇

(华侨大学 医学院, 福建 泉州 362021)

线粒体是一种重要的细胞器,是能量代谢和生物合成的关键场所,参与氧化还原稳态调节、信号转导、癌变、固有免疫、细胞凋亡和自噬等多种生物学过程[1-2],并且与衰老[3-5]、癌症[2,6],以及多种疾病[7]密切相关.人类的线粒体基因组为长度约16.6 kb的双链闭合环状脱氧核糖核酸(DNA),其基因排列紧凑,主要由13个蛋白编码基因、2个rRNA基因、22个tRNA基因,以及一段含有重(heavy,H)链复制起点的主非编码区域(major non-coding region,major NCR)和一段含有轻(light,L)链复制起点的次非编码区域(minor NCR)构成[8].近年来,有研究发现,线粒体DNA还存在短开放阅读框(short open reading frame,sORF),可编码,被称为线粒体源肽(mitochondrial-derived peptides,MDPs)的小肽,参与多种生物学过程[9-11].

大部分人类细胞中含有几百至几千个线粒体,每个线粒体的线粒DNA拷贝数约为2～10.线粒体DNA的拷贝数在不同个体及相同个体的不同组织和细胞中均有差异,且在不同生理条件下可发生变化.线粒体DNA拷贝数的多样性和可变性可以反映多种生理状态和生物学过程,具有作为生物标志物的重要潜力.本文对线粒体DNA拷贝数的多样性及其作为生物标志物的研究前景进行综述.

1 线粒体DNA拷贝数的多样性

1.1 线粒体DNA拷贝数在不同组织器官及生理条件下的差异

人类细胞中,细胞核基因组具有相对固定的拷贝数,而线粒体DNA的拷贝数则在不同组织中呈现出巨大的差异,从几百到数十万个不等.人类细胞中,仅成熟红细胞不含线粒体DNA.在生殖细胞中,成熟卵母细胞的线粒体DNA拷贝数为150 000以上,比大部分体细胞高一个数量级以上,而精子细胞线粒体DNA拷贝数仅约为100[12].线粒体DNA拷贝数在一定程度上与细胞能耗有关,例如,心脏和骨骼肌细胞等高耗能细胞平均线粒体DNA拷贝数为3 000～6 000,而肝脏、肾脏和肺组织的线粒体DNA拷贝数为500～2 000[13].

线粒体DNA拷贝数还与性别和年龄相关,女性的线粒体DNA拷贝数略高于男性,而线粒体DNA拷贝数可随着年龄的增长而降低[14-15].线粒体DNA拷贝数与生理状况也紧密相关,一项人群分析研究显示,线粒体DNA拷贝数与腰臀比相关,但与身体质量指数(body mass index,BMI)无关,提示其可能与中心性肥胖和体脂分布相关[14].线粒体DNA拷贝数在不同的细胞生理条件下精确调节,可响应不同的内部或外部微环境,并发生变化.

1.2 线粒体DNA拷贝数与衰老的相关性

半个多世纪以前,研究人员首次提出了线粒体功能障碍与衰老之间的关联[16].时至今日,越来越多的研究证据表明,线粒体功能的减退在衰老过程中扮演重要角色,是与年龄相关疾病的促进因素之一[3-4,17],而线粒体DNA突变则可引发早衰表现[18-19].

近年来,多项人群研究试图从线粒体DNA拷贝数的角度揭示线粒体与衰老之间的关联.随着人类年龄的增长,外周血细胞中的线粒体DNA拷贝数下降[20-21].Zhang等[20]通过对1 511名17～85岁女性人群的研究发现,外周血单核细胞中的线粒体DNA拷贝数平均每年以0.40的速度下降,同时伴随着线粒体DNA异质性的升高.Mengel-From等[21]通过对1 067名18～93岁的志愿者进行研究发现,18～48岁人群的外周血细胞中的线粒体DNA拷贝数相似,而50岁以上人群线粒体DNA拷贝数则以每年约0.54的速度下降;血液中线粒体DNA拷贝数与老年人的整体健康状况相关,线粒体DNA拷贝数较高的个体拥有更好的健康和存活状况,而线粒体DNA拷贝数较低的个体在认知、体力、自评健康等方面表现较差,且全因死亡率较高[21].Lee等[22]通过对107名表面健康老年女性(60岁以上)的研究发现,外周血白细胞中的线粒体DNA拷贝数与认知功能呈正相关.Kim等[23]对142名60岁以上的社区老年女性的研究发现,外周血白细胞中的线粒体DNA拷贝数与抑郁症呈现显著的负相关.

值得一提的是,不同的研究得出的结果并不总是一致的.例如,Reiling等[24]发现线粒体DNA拷贝数仅在男性中随着年龄增加而降低.一些其他的研究则显示线粒体DNA拷贝数与年龄无相关性[25-26].这些差异可能源于研究人群、样品类型和统计分析方法的不同,以及样本数量限制等因素.因此,更为系统及大规模的研究将有助于厘清和解释来自不同研究的差异.

1.3 线粒体DNA拷贝数与癌症的相关性

人类多种癌症中的线粒体DNA拷贝数存在异常[27].Reznik等[28]对癌症基因组图谱(cancer genome atlas,TCGA)计划中的22种癌症样本及相应的癌旁组织样本进行线粒体DNA拷贝数分析,发现许多癌症样本中的线粒体DNA拷贝数呈现下降趋势,尤其在膀胱癌、乳腺癌和肾癌中.在其他研究中,线粒体DNA拷贝数在不同癌症中既可表现为异常升高[29-35],也可表现为异常降低[36-39].由于不同类型的肿瘤中线粒体DNA拷贝数变化趋势不同,Lan等[40]推测某些肿瘤中线粒体DNA拷贝数的增加并不仅仅是肿瘤细胞增殖能力增强的结果,而是具有肿瘤类型特异性.

线粒体DNA拷贝数异常被认为与癌症风险具有相关性[40-47].Lan等[40]通过对ATBC(alpha-tocopherol,beta-carotene)癌症预防队列中的104例非霍奇金淋巴瘤患者及104例对照的研究发现,线粒体DNA拷贝数与非霍奇金淋巴瘤患病风险存在剂量反应关系,线粒体DNA拷贝数的增加对应着较高的患癌风险.Xing等[42]通过对260例肾细胞癌和281例对照的研究发现,肾细胞癌患者的线粒体DNA拷贝数显著低于对照,低线粒体DNA拷贝数与患癌风险的增加显著相关,且存在显著的剂量反应关系.Bonner等[43]对云南省宣威地区的肺癌患病风险与线粒体DNA拷贝数的相关性进行研究,该地区烟煤的广泛使用成为肺癌的重要致病因素之一,而烟煤中含有的多环芳香烃会在基因组DNA上形成加合物,其中,多环芳香烃对线粒体DNA的亲和性比对细胞核DNA的亲和性高40～90倍,因而可能对线粒体DNA拷贝数产生影响;通过对122名患者和121名对照的唾液样本线粒体DNA拷贝数的检测发现,当细胞中线粒体DNA拷贝数大于157时,罹患肺癌的风险显著升高,且线粒体DNA拷贝数与肺癌风险的相关性在老年人群中更为显著.Yu等[41]通过对59例浸润性乳腺肿瘤及配对的癌旁组织的分析发现,肿瘤组织中的线粒体DNA拷贝数显著低于癌旁组织,且降低的线粒体DNA拷贝数与较高的发病年龄及较高的组织学分级相关;线粒体DNA拷贝数降低的患者的无病生存率和总体生存率显著降低;D环(displacement loop,D-loop)区域尤其是H链复制起点区域附近的突变可能是导致线粒体DNA拷贝数降低的关键因素.目前,大部分人群研究仅针对某一特定癌症群人群或者族裔,此类研究尽管对特定问题具有较高的针对性,其结论有时难以推广和应用于更为广泛的人群.因此,未来的研究一方面应涉足更多样化的人群,另一方面也应关注样本量,以及人群差异对研究结论的影响.

多年来,研究者们致力于寻找用于癌症预测和筛查的分子标志物,其中,大部分研究关注与细胞核DNA相关的遗传和表观遗传变化,而近年来研究发现的线粒体DNA拷贝数与患癌风险之间的相关性使线粒体DNA拷贝数有望成为新的癌症预测和诊断标志物,并且相较于基于细胞核DNA的方法有其独特优势,是众多研究者所关注的研究方向.

1.4 线粒体DNA拷贝数与生育能力的相关性

已知线粒体功能异常影响生育能力,与线粒体相关的疗法可被用于延缓卵巢衰老及延长生殖寿命[48].线粒体DNA拷贝数也在愈来愈多的研究中被认为与生育能力具有相关性.Wai等[12]为探究线粒体DNA拷贝数对哺乳动物生育能力的影响,在小鼠中删除了一个拷贝的Tfam基因,人为降低线粒体DNA拷贝数,当卵母细胞的线粒体DNA拷贝数低至4 000时,仍可正常受精并在移植前发育至囊胚阶段,成熟卵母细胞植入后,可继续发育的阈值则为40 000～50 000;形成鲜明对比的是,精子的线粒体DNA拷贝数降低3倍之后,仍具有正常的生育能力,甚至缺失Tfam等位基因的基因型更容易被遗传.这些结果表明,成熟卵母细胞需要维持较高的线粒体DNA拷贝数来维持后续发育,而精子细胞则需要通过下调线粒体DNA拷贝数维持正常的功能.文献[49-50]关于精子形成过程中线粒体基因表达的研究也支持了减少精子中线粒体DNA拷贝数是维持精子正常功能的重要调控过程的观点.May-Panloup等[51]研究发现,卵巢功能不全患者的卵母细胞中线粒体DNA拷贝数平均下降约3倍.

此外,线粒体复制相关基因的缺陷会导致生育能力的下降[18,52-54].线粒体DNA拷贝数与生育能力的相关性使其有望作为卵巢功能和胚胎发育质量的标志物,在生殖治疗中发挥作用.Fragouli等[55]在一项研究中对199个囊胚进行分析,评估线粒体DNA拷贝数在体外受精(IVF)时作为胚胎质量筛选工具的适用性,发现所有正常着床的胚胎均具有正常或较少的线粒体DNA拷贝数,而有16%未着床胚胎中有较多的线粒体DNA拷贝数.这说明正常的线粒体DNA拷贝数尽管不能作为胚胎着床能力的标志,但是线粒体DNA拷贝数的增多却可用于筛查无法正常着床的胚胎[55].在现阶段,线粒体DNA拷贝数作为生殖能力评估工具已展现出一定的潜力和临床价值,为达到成熟的临床应用,相关研究还有待进一步深入.

2 循环细胞游离线粒体DNA

2.1 循环细胞游离线粒体DNA概述

循环细胞游离DNA(circulating cell-free DNA,ccf DNA)是从细胞内释放到细胞外并进入循环系统的DNA分子,由于其具有易于获取和测量的特点,已在多种疾病中成为重要的无创诊断生物标志物[56].线粒体DNA存在细胞外游离形式,被称为循环细胞游离线粒体DNA(circulating cell-free mtDNA,ccf mtDNA).细胞损伤或应激可引发线粒体损伤相关分子模式(mitochondrial damage-associated molecular pattern,DAMP)的释放,线粒体DNA在此过程中释放到细胞外空间,形成循环细胞游离线粒体DNA[57].循环细胞游离线粒体DNA存在于人类的血浆和血清中[58],被认为与炎症性疾病、创伤性损伤、败血症、心肌梗死与癌症等多种疾病相关[59-67],是新型生物标志物的潜在重要分子.

2.2 循环细胞游离线粒体DNA拷贝数与衰老的相关性

衰老被认为与慢性炎症有关,而循环细胞游离线粒体DNA拷贝数则被发现与炎症有紧密关联,因而循环细胞游离线粒体DNA被认为具有作为衰老及衰老相关疾病的生物标志物的潜能[57,67-68].

Pinti等[69]通过对831名志愿者(半数以上为90～104岁)血浆中的循环细胞游离线粒体DNA拷贝数的检测发现,志愿者在50岁之后逐渐增高.其中,具有最高血浆中循环细胞游离线粒体DNA拷贝数的志愿者的细胞炎症因子水平也相应最高,研究者据此推测循环细胞游离线粒体DNA拷贝数在维持老年人体内低程度慢性炎症方面发挥了作用[69].在另一项研究中,Lazo等[70]通过对数十名30～64岁人群的血浆中胞外囊泡中的循环细胞游离线粒体DNA拷贝数的定量分析发现,线粒体DNA拷贝数随着年龄的增加而降低.以上两项研究结论的不一致之处可能与受试者年龄段有关,前者的高龄人群比例显著高于后者.

Nidadavolu等[71]以672名社区老年人为研究对象,发现血清中的炎症标志物与循环细胞游离线粒体DNA拷贝数呈正相关,并且两者的水平与生理和认知功能的损伤及死亡风险的增加有关. 该研究提示了循环细胞游离线粒体DNA拷贝数与慢性炎症的相关性. Fan等[72]通过对65岁及以上的老年人退行性病变肌少症的研究发现,血浆中循环细胞游离线粒体DNA拷贝数与肌少症显著相关,在肌少症患者中显著增加,且通过接收者操作特征(ROC)曲线分析可有效地区分出肌少症患者(曲线下面积为0.726);循环细胞游离线粒体DNA拷贝数与细胞炎症因子水平存在正相关性,说明其可能与慢性炎症存在关联.以上研究表明,循环细胞游离线粒体DNA拷贝数可用于表征衰老与衰老相关疾病,其分子机制与细胞炎症反应密切相关.

2.3 循环细胞游离线粒体DNA拷贝数与癌症的相关性

循环细胞游离线粒体DNA存在于人体的血浆和血清中,具有易于检测的特性,适用于无创诊断,对于常规核心标志物水平正常的患者,基于循环细胞游离线粒体DNA的检测尤其具有特殊的意义.因此,近年来,循环细胞游离线粒体DNA在癌症诊断中的价值引起了广泛的研究兴趣.

Ellinger等[73]发现上皮性卵巢癌患者的血浆中循环细胞游离线粒体DNA拷贝数相比于健康对照,以及其他卵巢良性疾病患者均显著增高;上皮性卵巢癌组与子宫内膜异位症组相比,尽管循环细胞游离核DNA无显著差异,循环细胞游离线粒体DNA拷贝数却存在显著性差异.Ellinger等[74]通过对74例睾丸癌及35例健康对照的血清样品进行循环细胞游离线粒体DNA拷贝数的检测发现,睾丸癌患者的循环细胞游离线粒体DNA拷贝数显著高于健康对照,接收者操作特征曲线分析显示,循环细胞游离线粒体DNA拷贝数可用于区分癌症患者与健康对照(曲线下面积为0.787),并且可以用于区分常规标志物正常的患者与健康对照(曲线下面积为0.797),证明了循环细胞游线粒体DNA拷贝数作为生物标志物对于常规标志物正常的患者具有重要的诊断价值.

Ellinger等[75]发现循环细胞游离线粒体DNA拷贝数在泌尿系统恶性肿瘤患者的血清中显著增多,且可以用于区分癌症患者与健康对照,灵敏度和特异性分别达到85%和97%.Kohler等[59]在一项针对乳腺癌的研究中发现,循环细胞游离线粒体DNA拷贝数在恶性与良性肿瘤患者中均显著低于健康对照,而使用接收者操作特征曲线分析可有效地通过循环细胞游离线粒体DNA拷贝数区分肿瘤患者与健康对照.以上研究显示了循环细胞游离线粒体DNA拷贝数在癌症诊断中的良好应用前景,也提示了循环细胞游离线粒体DNA拷贝数在不同类型的癌症中可能具有不同的变化趋势,是具有癌症类型特异性的指标.

2.4 循环细胞游离线粒体DNA拷贝数与精神疾病的相关性

循环细胞游离线粒体DNA不仅与生理应激有关,还与心理应激相关,据推测可能在压力作用下被释放到细胞外,可作为精神疾病诊断的潜在生物标志物.

Trumpff等[76]对健康中年志愿者进行短暂的心理挑战试验,发现受试者血浆中的循环细胞游离线粒体DNA拷贝数增加2～3倍,说明循环细胞游离线粒体DNA拷贝数特异性与急性心理应激相关;体外细胞实验显示,糖皮质激素信号作为人类心理压力的产物之一,可诱导线粒体DNA拷贝数的增加,推测神经内分泌信号是心理应激下循环细胞游离线粒体DNA释放的潜在触发因素.

Lindqvist等[77]发现循环细胞游离线粒体DNA拷贝数是独立于细胞内线粒体DNA拷贝数的生物指标,重度抑郁症患者的血浆中循环细胞游离线粒体DNA拷贝数显著增加,而外周血单核细胞中的线粒体DNA拷贝数则无明显变化,说明两者指示了不同的生物学过程.Lindqvist等[78]通过对37名自杀未遂者和37名健康对照的血浆中循环细胞游离线粒体DNA拷贝数的定量分析发现,自杀未遂者的循环细胞游离线粒体DNA拷贝数显著增加,推测其与下丘脑-垂体-肾上腺轴的负反馈受损有关.Lindqvist等[79]后续通过对46名社交恐惧症患者和42名健康对照的血浆中循环细胞游离线粒体DNA拷贝数的检测发现,社交恐惧症患者的循环细胞游离线粒体DNA拷贝数显著少于健康对照;并且在认知行为疗法治疗后,循环细胞游离线粒体DNA拷贝数无显著变化,且与焦虑症状的严重程度无关,推测社交恐惧症患者可能是由于长期的心理压力导致循环细胞游离线粒体DNA拷贝数的减少.

值得一提的是,循环细胞游离线粒体DNA拷贝数在精神疾病中并非总是呈现上升趋势,不同研究者均在抑郁症人群中观察到了血浆中循环细胞游离线粒体DNA拷贝数显著减少的情况[80-81],说明在不同的精神疾病中,循环细胞游离线粒体DNA拷贝数可能存在不同的作用机制,有待于研究者的进一步揭示.

3 结束语

线粒体作为一种重要的细胞器,在人类的疾病和健康中扮演重要角色.线粒体DNA拷贝数作为一种易于检测的指标,被发现在衰老、癌症及其他多种疾病中具有特异性变化,是一种极具潜力的无创诊断生物标志物.目前,针对线粒体DNA拷贝数的相关研究主要集中于特定的疾病类型和人群,这些研究尽管得出了一些重要结论,其普适性还有待验证.在多种疾病类型中进行更为大规模和系统性的研究将有助于厘清先前研究中存在的一定程度的不一致性,增加线粒体DNA拷贝数作为生物标志物在临床上应用的可行性.此外,线粒体DNA拷贝数在衰老和疾病中的特异性变化的内在生物学机制还有待于被进一步揭示,从而更深入地理解线粒体及线粒体DNA拷贝数在疾病和健康中的作用.