南京地区草莓根腐病病原菌的分离及鉴定

丁春霞，姚淑伟，刘畅，杨平*，侯北伟**

（1.南京晓庄学院 食品科学学院，江苏 南京 211171；2.南京金色种业科技有限公司，江苏 南京 211200；3.中华全国供销合作总社南京野生植物综合利用研究所，江苏 南京 211100）

草莓（Fragaria×ananassaDuch.）为蔷薇科（Rosaceae）草莓属（FragariaL.）多年生草本植物，其果肉鲜美，含有特殊的浓郁芳香，富含VC，具有“水果皇后”之称，深受各国人民的喜爱［1］。而草莓根腐病已成为草莓产业发展的主要障碍之一，轻者影响草莓产量和品质，严重发病时造成草莓园毁灭，给果农带来巨大损失。草莓根腐病是由多种病原物和环境相互作用引起的一大类病害的总称。草莓根腐病在世界各处的草莓种植区均有发生，但是其致病菌种类因地区不同而产生差异。以西澳大利亚州草莓种植园的染病草莓为样本进行病原菌的分离鉴定，发现其主要病原菌为双核丝核菌（BinucleateRhizoctonia）［2］。研究发现引起厄瓜多尔草莓根腐病的主要病原菌为类拟盘多毛孢菌（Neopestalotiopsis mesopotamica）［3］，而引起捷克草莓根腐病的主要病原菌为疫霉菌（Phytophthora）［4］。

国内草莓根腐病致病菌也具有地区特异性，有研究报道北京市昌平区草莓根腐病的致病菌主要为棒形拟盘多毛孢（Pestalotiopsis clavispora）、胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）、尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）、立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）等［5］，北京市房山区草莓根腐病的致病菌为立枯丝核菌［6］，而另有报道北京地区的草莓根腐病样品的致病菌是暹罗炭疽菌（Colletotrichum siamense）和尖孢镰刀菌［7］。山东省作为我国的草莓生产大省，草莓根腐病致病菌的种类更加多样复杂。山东省草莓根腐病病株的毛霉返接草莓能再次引起草莓根腐病［8］，在山东烟台草莓根腐病病株曾分离到疫霉菌［9］。江苏草莓根腐病的致病菌主要为镰刀菌属（Fusariumsp.）和炭疽菌属（Colletotrichumsp.）的真菌［10-12］。在河南省新发现一种草霉病原菌为链格孢菌（Alternariaalternata）［13］。此外，取自陕西长安区的草莓根腐病样品的致病菌是大双孢土赤壳（Ilyonectria macrodidyma）［14］。

草莓根腐病的病原菌丰富多样，不同地区草莓根腐病的致病菌亦有所不同，因此，明确当地草莓根腐病致病菌对于针对性防治草莓根腐病具有重要意义。本研究拟探究南京溧水草莓基地草莓根腐病的致病菌，为当地高效防治草莓根腐病提供科学指导。

1 材料与方法

1.1 试验材料

草莓病样采自江苏省南京市溧水金色庄园草莓基地，草莓品种为‘红颜’。致病力检测试验所用草莓幼苗为金色庄园提供的匍匐茎上2 ～ 3分生枝的小苗，品种也为‘红颜’。

所用试剂与器材包括真菌基因组DNA提取试剂盒（南京诺唯赞生物科技股份有限公司），PCR常规酶（北京全式金生物技术有限公司），DNA Marker（BBI 生命科学有限公司），JY-ECP3000 电泳仪（北京君意东方电泳设备有限公司），Tanon 1600 凝胶成像仪（上海天能科技有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 病样采集及病原菌的分离和形态学鉴定

采集具有根腐症状的发病植株作为病害样品。用自来水多次冲洗病株表面后，将病健交界处切成1 cm × 2 cm的小块。用消毒后的镊子夹取置于70%乙醇溶液中浸制30 s，转至超净工作台中，无菌水冲洗3次，置于2% NaClO溶液中浸泡3 min，无菌水冲洗3次后，置于消毒后的滤纸上。将病害组织切成厚度约0.3 cm的薄片，每皿4片接于马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基上28℃条件下培养2 ～ 5 d。观察并挑取不同形态的菌株分离培养，多次分离纯化培养后保存备用。

在PDA培养基上观察菌株生长情况（菌丝特征、菌落颜色、基物颜色、是否产生孢子和菌核），通过光学显微镜观察菌丝形态、分隔状态等，根据以上信息对菌株进行初步分类。

1.2.2 病原菌的致病性鉴定

以金色庄园提供的草莓匍匐茎上2 ～ 3分生枝的小苗为实验材料进行返接试验，草莓苗在实验室环境进行适应生长，7 d后选取长势良好、生长状况一致的草莓幼苗，用75%乙醇消毒后的刀片对草莓幼苗进行伤根处理，通过灌根接种法分别在对照组和实验组接入50 mL的马铃薯葡萄糖液体培养基和等量孢子浓度为1 × 107CFU/mL的病原菌悬浮液，每盆两株草莓，每个处理重复3次。培育7 d后，采用相同方法再次接种，植物生长培养箱温度保持在27 ± 2℃。接种后每天观察草莓幼苗病害发生情况并做好记录。

1.2.3 分子鉴定

收集分离纯化培养后的病原体菌丝，将40 mg菌丝体移入无菌的1.5 mL离心管中，用CTAB法提取基因组DNA。将提取到的基因组DNA用1%（w/v）琼脂糖凝胶进行电泳验证。使用真菌通用引物ITS1和ITS4进行rDNA-ITS序列扩增（表1），引物由北京擎科生物科技有限公司合成。25 μL反应体系为2 × Taq Master Mix（ Dye Plus） 12.5 μL、引物ITS1和ITS4各1 μL、DNA模板1 μL、ddH2O 9.5 μL。扩增程序为95℃预热5 min，95℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸45 s，30个循环，最后72℃保持10 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，送擎科生物科技有限公司测序。测序结果在美国国家生物信息技术中心（NCBI）（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）进行Blast比对，下载与该序列同源性较高的已知菌株的序列，用Mega 7.0软件以邻接法构建单基因系统发育树，确定菌株的分类地位。

表1 本实验用到的引物Table 1 The primers used in this experiment

本研究同时选用ACT、GAPDH、TUB2、CHS基因，对菌株开展多基因联合分子鉴定，引物序列如表1所示，由北京擎科生物科技有限公司合成。

1.2.4 菌种保存

将经过验证鉴定为草莓根腐病病原菌的菌株在NA培养基上进行平板划线分离培养，28℃恒温培养36 h后得到单菌落，挑取单菌落置于25 mL NB培养液中，于28℃条件下以180 r/min的速度恒温震荡培养12 h，用分光光度计测定OD 600值为1.0 ～ 1.2的菌悬液作为试验菌液。用配置好的80%丙三醇和试验菌液按1 ∶ 1比例加入冷冻管内，混匀，-20℃冷冻短期保存，-80℃冷冻长期保存。所有菌种均保存在南京晓庄学院食品科学学院。

2 结果与分析

2.1 病原菌分离结果与形态观察

针对草莓根腐病问题，于南京市溧水区的草莓种植基地采集患根腐病的草莓植株，草莓的发病症状主要为：发病初期草莓植株的叶片整片发黄枯萎，发病后期植株叶片边缘呈萎蔫状甚至坏死，根茎处变褐发黑，根茎部表皮腐烂，根部（剖开后）有间断性病斑（图1）。

图1 草莓根腐病发病症状Fig 1 Symptom of strawberry root rot

从草莓染病植株中共分离到真菌20株（NJLS1 ～NJLS20），通过菌落形态初步分为3个形态种，菌株形态如图2所示，形态特征描述如表2所示。NJLS1等6个菌株长势较快，正面菌丝白色，呈羊毛状，背面呈浅棕色；NJLS2等9个菌株正面菌丝不长，呈白色地毯状，较密集，菌落背面散布黑点；这2个类型菌株在PDA培养基上28°C恒温培养4 ～5 d都可长满平板。而NJLS9等5个菌株菌落呈淡紫色，绒毛状，28°C恒温培养4 ～ 5 d仅可长满半个平板。

图2 菌株生物形态学的特征Fig 2 The characteristics of biological morphology of the strains

表2 病原菌形态特征描述Table 2 The morphological characteristics of the pathogens

2.2 病原菌致病性测定

将筛选到的20种真菌进行返接试验，每种菌株2个接菌量处理，每个处理重复3次。草莓植株接入编号为NJLS2、NJLS6、NJLS7的菌株7 d后，其叶片表现出发病症状；14 d时，纤维状的根部腐烂很明显，剖开根部后发现在根茎交界处可见褐色的病变，这与田间病害的症状一致（见图3）。对照组生长正常，没有表现出任何症状，接种其他分离菌的草莓植株在本实验中也没有发生病害（图4），可以确定NJLS2、NJLS6、NJLS7菌株侵染草莓后可引起草莓根腐病。

图3 草莓植株接种病原菌后发病症状Fig. 3 Symptoms of strawberry plants inoculated with pathogen

图4 其余真菌接种草莓14天症状Fig. 4 Symptoms of strawberry inoculated with the other fungi for 14 d

2.3 病原菌分子生物学鉴定

2.3.1 ITS初步鉴定

以ITS1、ITS4为引物、以20个菌株的基因组DNA为模板进行PCR扩增，电泳结果表明20个条带的长度符合预期（图5）。8 μL胶回收提取产物于离心管中送至擎科生物公司进行测序。将测序结果上传至NCBI进行Blast分析，结果显示经过ITS序列初步鉴定，可以将分离得到的20株真菌分为3个属，分别是：镰刀菌属6株、炭疽菌属9株、木霉属（Trichodermasp.）5株，具体的初步鉴定结果见表4。其中侵染试验中草莓植株表现出发病症状的3个菌株NJLS2、NJLS6、NJLS7均属于炭疽菌属。

图5 20株菌株的PCR产物电泳条带图Fig. 5 The gel electrophoresis picture of PCR amplication products of 20 strains

表4 菌株的ITS初步鉴定结果Table 4 Preliminary identification results of strains used ITS

2.3.2 多基因联合分子鉴定

本研究选取ACT、GAPDH、TUB2、CHS基因及ITS片段对初步鉴定为炭疽菌的3个菌株（NJLS2、NJLS6、NJLS7）进行扩增，PCR产物的长度均在100 ～ 1 000 bp之间，条带大小符合预期，胶回收后将扩增产物送测序。从GenBank上下载已知菌株对应的基因序列，将测序结果进行Blast剪切以后，以ITS、ACT、GAPDH、TUB2、CHS的排列顺序串联序列，并利用Mega软件构建系统发育树。如图6所示，NJLS2、NJLS6、NJLS7与暹罗炭疽菌的同源性为100，结合菌落形态和ITS序列比对结果，确定NJLS2、NJLS6、NJLS7这三株致病菌为暹罗炭疽菌。

图6 基于多基因序列的草莓根腐病病原菌系统进化树Fig. 6 Phylogenetic tree of strawberry root rot pathogens based on polygene sequence

3 结论与讨论

由于ITS的种间差异较大，通常可以通过ITS序列确定真菌的分类地位，但是在构建亲缘关系较近菌种的系统发育树时ITS具有一定的局限性，可能出现由于某些关键进化节点支持率低导致鉴定结果不一致的情况。近几年的研究表明，由于ITS保守性较高，不能够将炭疽菌属真菌准确鉴定到种，因此可采用多基因拼接序列构建系统发育树。目前对炭疽菌属鉴定的主要基因位点有ACT、CHS、GAPDH、TUB2［15］。基于此，本研究采用上述4个基因序列对分离到的炭疽菌进行多基因联合鉴定，结果显示本试验中引起草莓根腐病的3株菌株均为暹罗炭疽菌。

本试验从草莓根腐病植株共分离到20株真菌，通过返接试验进行致病性测定筛选到了3株有致病性的菌株：NJLS2、NJLS6、NJLS7。通过形态学和ITS序列初步将20株真菌分为3类，其中镰刀菌属6株，炭疽菌属9株，木霉属5株。根据ITS、ACT、GAPDH、TUB2、CHS多基因联合测序结果，结合病原菌形态学特征鉴定发现引起溧水区草莓根腐病的是暹罗炭疽菌。张方博［16］在北京市昌平区、大兴区及呼和浩特市进行草莓病害的调查，最终确定胶胞炭疽菌复合种中暹罗刺盘孢菌和尖孢镰刀菌为草莓根腐病的主要致病菌；王铃朝等［17］在青岛莱西地区确定了6种草莓根腐病的致病真菌，其中胶孢炭疽菌、尖孢镰刀菌是优势致病菌；王慧瑜［18］等研究表明引起郑州地区草莓根腐病的致病菌为双核丝核菌。综合多个研究结果发现，不同地区的病原菌存在差异，但在这些调查中炭疽菌属均是主要病原菌，这与本试验病原菌分离的结果是一致的。

本试验从草莓根腐病病株共分离得到3个属的20个菌株，其中6个隶属镰刀菌属，9个隶属炭疽菌属。镰刀菌属和炭疽菌属菌株都能引起草莓根腐病，但是本试验致病性测定中，只有炭疽菌属中3株菌株返接后使草莓致病，其余病原菌接入后草莓植株均正常生长，可能由于不同菌株的致病力存在差异。盖晓彤等［19］从云南省分离到227株烟草根腐病的致病菌，经鉴定均为尖孢镰刀菌，而通过致病力测定发现有12株不具有致病性。王昶等［20］从甘肃5个不同生态区的藜麦上分离到5株病原菌，分析发现不同菌株之间的致病力存在显著差异，甘肃临夏二阴区菌株的致病力为90.00（病情指数），甘肃天祝区菌株的致病力仅为44.67。

江苏草莓根腐病的致病菌主要为镰刀菌属和炭疽菌属的真菌［10-12］。本试验对南京市溧水区的草莓根腐病病株进行样品采集、病原菌的分离和致病性测定，最终明确致病菌为暹罗炭疽菌，这是暹罗炭疽菌在南京地区草莓病害研究中的首次报道。后续试验将围绕炭疽菌的生物学特性、寄主范围、侵染机制和致病机理展开研究，为南京市溧水地区有效防治草莓根腐病以及选育抗病品种提供理论依据。