徐长卿洗剂治疗马拉色菌感染的实验研究

谢阿贵

（1.片仔癀（上海）生物科技研发有限公司，上海 200030； 2.福建片仔癀化妆品有限公司，福建 漳州，363000）

“头发有弹性，有自然光泽，没有头屑”是世界卫生组织公布的身体健康的标准之一［1］。由于环境污染的逐步加重以及人们生活压力增大等多方面因素的影响，头发黯淡无光、脱发短发、头皮屑滋生、头皮瘙痒等一系列问题随之而来，这给人们的日常生活带来了烦恼，甚至影响了身心健康［2］。在临床上，头皮脱落的原因主要包含单纯头皮屑脱落及脂溢性皮炎［3］。单纯头皮屑是指“正常”的头皮所脱落的灰白色疏松干燥的小片状鳞屑；脂溢性皮炎是一种皮脂溢出区的慢性炎症性皮肤病，通常表现为鳞屑增多、头皮瘙痒、基底泛红，严重者头皮会出现红斑且有黏性物质渗出［4-5］。

马拉色菌是生长在人类皮肤角质层的常驻菌，它能破坏头皮微环境，导致头部表皮细胞代谢紊乱，产生大量头皮屑［6］。因此，头皮去屑止痒的关键就在于抑制马拉色菌的过度生长，改善头皮微环境，进而抑制头皮炎症的发生［7］。目前临床上使用的去屑洗护用品大致分为三个类型：抗真菌制剂、角质层剥脱剂、角质层细胞生长抑制剂。长期使用这类制剂会破坏头皮微环境，对皮肤产生刺激，发生头皮干燥易过敏等现象［8-10］。

近年来中外文献开始深入研究中药提取物对头皮去屑止痒的功效，侧柏叶、当归、白鲜皮、苦参等多种中药已被发现具有明显抑制马拉色菌的作用［11-12］。另外，研究发现部分中药提取物同时具有显著的抗炎效果，且因其具有绿色天然、安全可靠、种类齐全等多种优势，具有很高的研究价值［13-17］。本研究选用徐长卿洗剂（出自《中医皮肤病学简编》，有调整）进行体外抗菌、抗炎和豚鼠皮肤感染马拉色菌的治疗实验，研究其去屑止痒功效。

1 材料

1.1 药品及试剂

药材徐长卿、黄连、蔓荆子、五倍子由江苏省中医药研究院提供，并由江苏省中医药研究院苏克雷博士鉴定。

沙氏葡萄糖琼脂（SDA）培养基购自广东环凯微生物科技有限公司；DMEM培养基、胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶、磷酸缓冲盐溶液、脂多糖（Lipopolysaccharide， LPS）均购自国药集团化学试剂有限公司；反转录及荧光定量试剂盒购自上海优宁维生物科技股份有限公司；酶联免疫吸附剂测定（Enzyme linked immunosorbent assay， ELISA）试剂盒购自上海联硕生物科技有限公司。

1.2 菌株、细胞及动物

马拉色菌（北京北纳创联生物技术研究院）；RAW264.7细胞（北京北纳创联生物技术研究院）；雄性豚鼠（北京维通利华实验动物技术有限公司）。本实验相关动物实验于扬州大学比较医学中心开展，合格证号SYXK（苏）2016-0019。

1.3 仪器型号

SPX-150B-Z型生化培养箱（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；BX41奥林巴斯显微镜（南京艾朗仪器有限公司）；ReadMax 1000F酶标仪（美国BioTek 公司）；SU8600扫描电镜（日本日立公司）。

2 方法

2.1 徐长卿洗剂的制备

徐长卿洗剂由徐长卿30 g、黄连20 g、蔓荆子20 g、五倍子10 g组成。将药材置于 10倍体积的蒸馏水中浸泡30 min，加热到100℃，加热 1 h 后除去药渣，获得滤液。再补充 8 倍体积的蒸馏水于同样的条件下第二次加热。将两次获得的滤液混合，得到浓度为0.056 g/mL的样品并分装保存于-80℃冰箱。

2.2 最低杀菌浓度测定

将接种马拉色菌的含药培养基置于32℃培养箱中孵育4 d，同时设立阳性对照和阴性对照。阳性对照：取抑菌实验阳性对照管的生长菌接种于不含药物的培养基；阴性对照：不加菌且不含药物的培养基。孵育结束后，在自然光线下通过肉眼判读菌落生长情况。判定结果要求：阴性对照管清晰透明，无菌落生长，阳性对照管菌落生长良好，将每管生长情况与对照管相比较，以无培养物生长的培养基所使用的最低浓度作为最低杀菌浓度（Minimal fungicidal concentration， MFC）。

2.3 扫描电镜观察药物处理的马拉色菌

将药物处理的马拉色菌培养液在1 500 r/min条件下离心10 min，弃上清，置于pH 7.4的2.5%戊二醛磷酸缓冲液中固定24 h。随后，用1%锇酸固定2 h，再用丙酮逐级脱水，环氧树脂浸透包埋后制备超薄切片，用醋酸双氧铀和枸橼酸铅溶液进行染色，最后使用扫描电镜观察菌体形态。

2.4 细胞培养

将RAW264.7细胞置于DMEM培养基中，添加10% FBS及1%双抗（抗核抗体和抗双链DNA抗体），随后在含5% CO2的细胞培养箱中于37℃条件下培养。

2.5 转录水平检测tnf-α及il-6 的表达

参照吴阳阳等［18］的方法，取对数生长期的RAW264.7细胞，将细胞浓度调整为1 × 105个/mL的单细胞悬液，接种于24孔细胞培养板中，培养过夜；将各孔培养液弃去，分组处理，使用LPS诱导细胞因子表达上调，加入不同浓度（0.1、1、10 mg/mL）的样品溶液，空白对照组加含2%胎牛血清的DMEM培养液，每组平行3孔，测定每组基因的相对表达量。

2.6 ELISA方法检测TNF-α及IL-6的表达

将药物加入培养的RAW264.7细胞中共同孵育24 h后，取细胞上清，采用ELISA试剂盒检测肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-α， TNF-α）及白细胞介素-6（Interleukin-6， IL-6）；按照试剂盒说明书要求稀释标准品备用，分别设空白孔、标准孔、待测样品孔，酶标包被反应完成后使用酶标仪检测OD值。

2.7 豚鼠皮肤马拉色菌感染动物模型的建立

将马拉色菌在沙氏葡萄糖琼脂培养基上连续传代培养2次，第2次传代培养于32℃恒温孵育72 h后，用无菌接种环取适当数量菌落于0.9%氯化钠无菌玻璃试管中，反复吹吸，震荡摇匀制成菌悬液，通过显微镜在血胞计数板上计数将浓度调整为1 ×109CFU/mL。

用理发器将豚鼠背部毛发剃除约3 cm × 3 cm的区域，露出无毛区，用磷酸缓冲盐溶液反复清洗除去残留脱毛膏，电吹风机吹干豚鼠毛发，酒精消毒脱毛区域。使用粗砂纸在脱毛区反复均匀地摩擦至皮肤泛红，然后取100 μL上述菌悬液均匀涂抹于脱毛区，每只豚鼠每日涂抹一次，连续抹菌7 d。

2.8 药物外用于感染马拉色菌的豚鼠皮肤

空白对照组：皮损处不用药，观察其自然转归情况；药物治疗组：皮损处外用中药复方提取液；阳性对照组：皮损处外用酮康唑。造模成功后次日，每日涂药2次，疗程2周。

2.9 评价抑菌效果

于治疗第0 d、7 d、14 d、21 d评估皮损积分（表1）［19］。以4%的水合氯醛作为麻醉剂，通过腹腔注射将实验各组豚鼠麻醉后，在背部感染区皮肤用75%酒精棉球消毒，每只豚鼠剪下直径约1.5 cm圆形皮损1块，剪碎，置于装有2 mL 0.9%生理盐水的玻璃匀浆器中，加入0.5%吐温80，充分匀浆，使成混悬液，取300 μL混悬液均匀涂布于马拉色菌固体培养基的圆形平皿上，轻轻晃动培养皿，使其均匀分布于培养皿表面，在32℃条件下静置培养3 d，观察并记录其菌落形成单位（CFU）。若每个培养皿中的CFU ＞ 1，则视其为阳性。真菌学转阴率（%） = 每组培养阴性数/每组感染动物总数 × 100%。感染处皮肤经苏木精-伊红染色法（HE）染色后镜下观察并拍照记录。豚鼠眼后静脉丛中取血并分离血清。通过ELISA实验检测血清中干扰素γ（Interferon -γ，INF-γ）、白介素-4（Interleukin-4， IL-4）、白介素-2（Interleukin-2， IL-2）、白介素-10（Interleukin-10，IL-10）含量。

表1 豚鼠感染区皮损评分表Tab.1 Scoresheet of infected skin injury on guinea pigs

3 结果

3.1 徐长卿洗剂的体外抗菌活性

徐长卿洗剂的体外抗菌活性检测结果发现其对马拉色菌的MFC值为1.25 mg/mL。扫描电镜结果显示，经药物处理后，马拉色菌菌体破碎，无正常菌体形态，说明徐长卿洗剂具有明显的抗菌效果（图1）。

图1 扫描电镜观察马拉色菌形态Fig.1 The morphology of Malassezia observed by scanning electron microscope

3.2 徐长卿洗剂的体外抗炎作用

3.2.1 转录水平检测tnf-α及il-6的表达

qRT-PCR检测模型组LPS诱导的RAW264.7细胞中炎症因子的变化情况，如图2显示，LPS处理后RAW264.7细胞中tnf-α及il-6表达明显高于空白对照组（P＜ 0.001）。而相较于模型组，徐长卿洗剂能显著降低tnf-α及il-6的表达量，并体现出剂量依赖性（P＜ 0.01），表明徐长卿洗剂具有抑制炎症的作用。

图2 徐长卿洗剂对LPS诱导RAW264.7细胞tnf-α（A）及il-6（B）转录水平表达的影响Fig.2 The mRNA levels of tnf-α and il-6 in LPS-treated RAW264.7 cells detected by qRT-PCR after V.pycnostelma Lotion treatment

3.2.2 翻译水平检测TNF-α及IL-6 的表达

为进一步验证TNF-α及IL-6的表达情况，通过ELISA方法检测其含量。如图3所示，LPS可以显著提高RAW264.7细胞TNF-α及IL-6的表达，而徐长卿洗剂处理后可以显著抑制模型组LPS引起的TNF-α、IL-6释放，且抑制效果具有剂量依赖性，表明徐长卿洗剂具有明显的抗炎作用，且ELISA在蛋白水平的检测结果与转录水平结果一致。

图3 徐长卿洗剂对LPS诱导RAW264.7细胞TNF-α及IL-6翻译水平表达的影响Fig.3 The protein levels of TNF-α and IL-6 in LPS-treated RAW264.7 cells detected by ELISA methods after V.pycnostelma Lotion treatment

3.3 徐长卿洗剂对豚鼠皮肤感染马拉色菌的治疗作用

3.3.1 徐长卿洗剂对豚鼠皮肤感染马拉色菌的干预作用

根据表1方法，设立空白对照组、模型组、阳性对照组以及给药组，其中空白对照组不做处理，模型组为豚鼠皮肤感染马拉色菌模型，阳性对照组以酮康唑进行给药，给药组为10 mg/mL徐长卿洗剂进行给药，分别于用药的第0、7、14、21 d对豚鼠模型皮损情况进行评分。分别于用药的第0、7、14、21 d对豚鼠模型皮损情况进行评分。如图4所示，连续观察3周后发现，模型组皮损呈现较高水平且随时间变化不明显，而徐长卿洗剂组皮损评分显著下降，与阳性对照组效果类似，表明徐长卿洗剂能明显改善马拉色菌感染的皮肤损伤。

图4 马拉色菌感染豚鼠皮损积分Fig.4 Scores of infected skin injury on guinea pigs

3.3.2 徐长卿洗剂对豚鼠皮肤马拉色菌感染的抑菌效果

马拉色菌感染豚鼠真菌学治愈率比较结果显示（表2），徐长卿洗剂与阳性对照组转阴率均为70%，模型组真菌学治愈率为0，二者与模型组之间具有显著统计学差异（P＜ 0.05），两种药物之间无统计学差异（P＞ 0.05）。实验各组真菌培养菌落数分析结果（图5）显示，徐长卿洗剂组、阳性对照组与模型组菌落培养数具有显著差异（P＜ 0.000 1），均值比较表现为：阳性对照组 ＜ 徐长卿洗剂组 ＜ 模型组。

图5 马拉色菌感染豚鼠真菌培养菌落数比较Fig.5 Comparasion of fungal CFU of Malassezia infected guinea pigs

表2 马拉色菌感染豚鼠真菌学治愈率比较Tab.2 Comparasion of cure rates of Malassezia infected guinea pigs

3.3.3 HE染色观察

如图6所示，正常对照组皮肤完整、无损伤；而模型组表皮层被破坏，并伴随大量炎症细胞浸润；阳性对照组及徐长卿洗剂治疗组观察到皮肤结构完整、毛囊清晰，与正常组皮肤类似。

图6 皮肤HE染色Fig.6 HE staining of skin

3.3.4 徐长卿洗剂对机体免疫的影响

Th1细胞主要介导机体的细胞免疫反应，其分泌的INF-γ能够抵御细菌、真菌及病毒感染，是体内重要的免疫调节因子。Th1细胞产生的另一种细胞因子IL-2具有刺激活化NK细胞、B细胞及T细胞的作用，在机体抗感染中具有重要地位［20］。Th2细胞主要介导体液免疫反应，其分泌的IL-4、IL-10等细胞因子能够下调Th1细胞与抗原递呈细胞活性［21］。研究发现，机体的Th1/Th2细胞处于动态平衡，一旦平衡被打破，机体则存在免疫失衡的风险［19］。

豚鼠血清IL-2、INF-γ研究结果表明（图7 AB），模型组的IL-2和INF-γ表达水平较正常组显著降低（P＜ 0.001）。与模型组相比，徐长卿洗剂组与阳性对照组中IL-2和INF-γ的表达水平明显升高，且差异具有统计学意义（P＜ 0.05）。徐长卿洗剂组与阳性对照组之间无统计学差异（P＞ 0.05）。图7 C-D结果发现，模型组豚鼠血清中IL-4及IL-10表达较正常组、徐长卿洗剂组、阳性对照组显著升高（P＜ 0.05），徐长卿洗剂组与阳性对照组相较于模型组能显著降低血清中IL-4及IL-10含量，表明两种药物均能有效干预豚鼠血清中Th2细胞主要效应因子，改善免疫失衡状态，两组药物之间的差异没有统计学意义（P＞ 0.05）。

图7 马拉色菌感染豚鼠血清中IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10的含量Fig.7 Contents of IL-2， IFN-γ， IL-4 and IL-10 in serum of Malassezia infected guinea pig

4 讨论

马拉色菌是人体和其它动物皮肤表面的常见菌群，与脂溢性皮炎等皮肤疾病密切相关，病程的进展给人们生活带来了极大的困扰［22］。徐长卿洗剂出自《中医皮肤病学简编》，由徐长卿、黄连、蔓荆子及五倍子组成，主治牛皮癣及带状疱疹等皮肤疾病，可进行内服或外洗。现代药理学研究表明，徐长卿具有显著的抗炎、抗菌、抗病毒及神经保护等作用［23］；黄连、蔓荆子及五倍子亦具有广泛的抗炎、抗菌等药理作用［24-26］。以上研究为徐长卿洗剂治疗马拉色菌感染的脂溢性皮炎提供了依据。

徐长卿洗剂体外抗菌、抗炎和豚鼠皮肤感染马拉色菌的治疗试验结果表明，其具有显著抑制马拉色菌的效果，MFC为1.25 mg/mL，同时扫描电镜结果发现徐长卿洗剂可以明显破坏马拉色菌菌体，进一步证明了其抗菌效果。体外培养的RAW264.7细胞抗炎实验发现，徐长卿洗剂处理组可以明显抑制LPS诱导升高的TNF-α、IL-6水平。豚鼠皮肤感染马拉色菌模型的治疗结果发现，徐长卿洗剂可以明显恢复马拉色菌诱导的皮肤损伤。HE染色结果发现徐长卿洗剂治疗组可以观察到完整的皮肤结构，且毛囊清晰，与正常组皮肤类似。此外，研究结果表明，徐长卿洗剂可以恢复Th1细胞中介导细胞免疫的IL-2、INF-γ表达，表明其具有明显的抵御细菌、真菌及病毒感染以及刺激活化T细胞、B细胞、NK细胞并促进其增殖及分泌细胞因子的作用，增强了机体抗病毒及微生物感染的能力。同时，徐长卿洗剂能够恢复Th2细胞介导机体体液免疫中IL-4、IL-10表达，表明其具有明显的促进T细胞增殖、B细胞活化和抗炎作用，使Th1/Th2细胞处于动态平衡，对Th1/Th2漂移起到调节作用，这可能是徐长卿洗剂抑制炎症及脱屑症状、清除真菌的潜在机制。本研究表明，徐长卿洗剂在去屑止痒功效方面具有极大的应用价值，为后续临床应用指明了方向。