多杀性巴氏杆菌分型技术及毒力因子研究进展

郭亚男，张正刚,2，马 科，张久盘，王建东*

（1.宁夏农林科学院动物科学研究所，宁夏 银川 750002；2.宁夏大学 农学院，宁夏 银川 750021；3.宁夏同心县科技服务中心，宁夏 同心 751300）

多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocid，P.multocida）由Louis Pasteur于1887年首次在禽霍乱病例中分离得到，命名为巴斯德氏菌。它主要存在于动物口腔、鼻咽和上呼吸道，能够引起家畜和野生动物及人类感染[1]，1994年被分为3个亚种[2]，目前的分型方法主要有荚膜分型法、脂多糖分型法和MLST分型法。

P.multocida发病机制的分子基础主要涉及荚膜、脂多糖（LPS）、鞭毛、粘附素、多杀性疟原虫毒素（PMT）和外膜蛋白等毒力因子[3]。毒力因子使细菌能够在宿主体内繁殖，并且破坏或躲避宿主的防御系统。一些毒力因子可增强P.multocida在环境中的生存能力，在P.multocida中的毒力因子主要包括粘附、定植功能的相关蛋白质、铁捕获蛋白（ExbB、ExbD、TonB、HgbA、HgbB和Fur）、细胞外酶，例如神经氨酸酶（NanB和NanH）和超氧化物歧化酶（SodA、SodC和TbpA）、透明质酸酶（PmHAS）、毒素（ToxA）、脂多糖（LPS），荚膜和外膜蛋白（OmpA、OmpH、Oma87和PlpB）[4]。这些VF能够促进宿主的定植和入侵，破坏宿主防御机制，损伤宿主组织，或刺激有害宿主炎症反应。本文就多杀性巴氏杆菌的分型方法和毒力因子进行概述，以期为该病原的相关研究提供理论依据。

1 多杀性巴氏杆菌分型技术研究进展

1.1 多杀性巴氏杆菌荚膜分型

P.multocida可以根据荚膜（A、B、D、E和F）的组成分为不同血清型，可以根据表达的LPS抗原进一步分为16种血清型[5-6]，该分型系统涉及荚膜血清型A的hyaD-hyaC基因（参与透明质酸合成）、荚膜血清型D的dcbF基因（参与肝素合成）、荚膜血清型F的fcbD基因（参与软骨素生成）以及荚膜血清型B和E的bcbD和ecbJ基因（均参与糖基转移酶合成）[7]。有荚膜的P.multocida菌株比无荚膜的菌株更具毒性，能逃避宿主免疫识别并降低免疫细胞的吞噬功能[8]，B型和E型菌株在牛和水牛中引起出血性败血症（HS），而家禽禽霍乱是由A型和F型菌株引起的。A型和D型菌株可引起兔鼻炎，牛、羊和猪的肺炎[9]。自限性或慢性感染症状相对轻微，但许多上呼吸道和全身感染可在1～2 d内致命[10]，且具有高度传播性，在野生动物和驯养的动物种群中均有大规模暴发报道。Confer AW等[11]的研究表明，从肺病变中分离出的P.multocida有61%和25%分别属于荚膜A型和D型。

1.2 多杀性巴氏杆菌脂多糖分型

脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）也是重要的毒力因子，在对P.multocida LPS结构及其合成基因簇深入分析的基础上，Harper等[5]发现可将P.multocida分为L1～L8共8个基因型，并建立了对应的特异性PCR分型方法；Heddleston等[13]将P.multocida分为1～16共16种脂多糖血清型。此外，P.multocida LPS是一种免疫显性抗原，对细菌（杀伤细胞）疫苗刺激的同源保护至关重要。

1.3 多位点序列分型

针对P.multocida建立的MLST方案，最初设计用于对禽类分离株进行分类，之后国际研究界也一直使用这种方法对其他几种宿主物种进行分型[13]。MLST是一种通过对管家基因的内部片段进行测序来表征细菌分离株的方法[14]，通常与其他基因型方法结合使用。Subaaharan等[15]报道MLST方法对病原体流行病学研究，在特异性、稳定性上更具优势。

2 多杀性巴氏杆菌毒力因子研究进展

2.1 脂多糖

脂多糖（LPS）是P.multocida的主要免疫原性毒力因子之一，几乎所有革兰氏阴性菌的外膜主要由LPS构成[16]，因此LPS在细菌与环境之间的相互作用中起着至关重要的作用，并且与膜屏障功能、细菌毒力和宿主免疫密切相关。LPS包含3～4个区域：脂质A，作为膜锚定成分；内核，通常含有1～3个3-脱氧-d-甘露糖-辛酸-2-洛糖酸（Kdo）残基和庚糖；外核，由多种糖组成，通常包括葡萄糖、半乳糖、半乳糖胺和葡萄糖胺；O-抗原（O-多糖），由高度可变且重复的寡糖单元组成[17]。脂质A是LPS的内毒性成分，强烈刺激先天性和适应性免疫反应。LPS的脂质A可通过能够识别常见的病原体相关分子模式（PAMP）的Toll样受体蛋白家族成员Toll样受体4（TLR4）刺激先天性免疫系统细胞[18]。Rathinam等[19]的研究表明，P.multocida的LPS交叉保护性极弱。Periasamy等[20]的研究表明，P.multocida的LPS能够刺激牛粒细胞增殖，并促进炎性因子表达。

2.2 荚膜多糖

荚膜多糖（CPS）是高分子量的细胞表面多糖，是许多致病菌的重要毒力因子，通过增强细菌的毒性而发挥致病性，影响防御细胞和细菌间的平衡[21]。荚膜具有保护细菌抵抗宿主吞噬细胞的吞噬和消化的作用，在恶劣环境条件下阻断大多数噬菌体感染[22]。Boyce等[8]的研究表明，P.multocida CPS可以逃避宿主吞噬细胞的吞噬或摄取，通过向小鼠腹腔内注射菌株进行毒力测试，毒力激发后有荚膜的细菌能够抵抗吞噬细胞的摄取，从而大量繁殖，无荚膜的细菌很容易被小鼠腹膜巨噬细胞吸收，能够从血液、脾脏和肝脏中有效清除。在革兰氏阴性细菌中，大多数CPS由Wzy依赖性或ATP结合（ABC）转运蛋白依赖途径组成[23]。CPS可保护菌体表面不被补体和抗体影响，从而防止菌体被吞噬和灭活[24]，CPS血清A组由透明质酸组成，血清D组是易受降解硫酸软骨素A和C以及肝素酶影响的多糖，血清F组是类似软骨素的多糖，血清型B型CPS主要由甘露糖组成，但也含有阿拉伯糖和半乳糖，血清型E菌株的CPS组成尚未确定[25]。

2.3 铁调节和铁捕获蛋白

铁是P.multocida等致病菌最重要的营养素之一，宿主中游离铁的含量不多[26-27]。P.multocida中的铁可能对其存活和发病机制起重要作用，与铁相关基因的表达调节通常由革兰氏阴性细菌中的毛皮基因控制[28]。当铁含量丰富时，毛皮与亚铁相互作用并与保守启动子区域结合抑制基因转录[29]。铁载体是与蛋白质载体竞争、与三价铁结合的铁配体，而一些外膜蛋白也可以从宿主铁结合分子（如乳铁蛋白、血红素、铁蛋白、血红蛋白和转铁蛋白）中获得铁[30-31]。HgbA和HgbB是2种蛋白质，由P.multocida直接从血红素成分中获取铁。据报道，HgbA基因在分离株中分布得更规律，而HgbB基因患病率因宿主来源和动物疾病状况而异。据报道，另一种称为转铁蛋白结合蛋白A（TbpA），在牛中作为流行病学标志物，在铁的运输中起着至关重要的作用[32]。P.multocida物种中多个铁采集系统的存在可能解释了其在某些条件下利用一组特定的基因在铁有限条件下获取铁的能力。DNA微阵列研究了P.multocida在无铁培养基中添加不同铁源后，对捕获不同铁源的基因表达模式。

2.4 外膜蛋白

NanB、NanH、ompH、plpB和psl基因的产物是参与营养获取和运输的外膜蛋白（OMP）。革兰氏阴性菌的OMP在引发疾病过程中起着至关重要的作用。它们参与生产性感染所需的营养摄取、分子进出细胞的运输、宿主的定植和入侵、宿主免疫反应的逃避、宿主组织的损伤等过程[33]。多杀性巴氏杆菌OmpA蛋白可以与C4b蛋白结合，具有免疫逃避作用[34]；OmpH蛋白约占荚膜A型多杀性巴氏杆菌荚膜总蛋白的27%，敲除OmpH基因后，其荚膜含量也显著降低，表明该蛋白与荚膜形成有关[35-36]。此外，这些OMP是良好的免疫原，可用作疫苗成分为机体提供保护[37]。因此，分离株之间的OMP变异可以通过评估其菌株间异质性来帮助流行病学调查，并可用于评估种内多样性[38]。

2.5 菌毛和粘附素

细菌粘附素是一种重要的细菌毒力因子，是细菌定植的先决条件之一，它对靶分子具有精确的选择性，并以锁定和钥匙模式识别分子基序[39]。粘附素是一类表面结合的蛋白质，可促进细菌附着到宿主组织。它们根据蛋白质中外膜锚的缺失或存在分别被分类为菌毛性或非菌毛性。在不同类型的粘附素中，细菌凝集素是最常见的，能够识别和结合特定的糖分子[40]。粘附素的粘附性是通过识别宿主细胞表面呈现的特定碳水化合物、蛋白质或脂质来实现的。除了粘附外，粘附素还通过毒力基因的上调促进毒素传递，从而导致宿主入侵。此外，这种相互作用可引发宿主分泌细胞因子或噬菌素，从而加剧疾病[41]。

2.6 超氧化物歧化酶

超氧化物歧化酶（SOD）是在1938前发现的[42]，SOD是一种金属酶，形成一线抗氧化防御机制，是解毒超氧自由基的主要酶组分之一[43]，绝大多数生活在氧气下的生物都至少表达一种SOD。超氧化物歧化酶sodA和sodC在氧化应激反应和抗氧化应激中很重要[44]。含有sodA基因编码的蛋白可以和锰的超氧化物歧化酶结合，清除吞噬细胞中的超氧化物及中和超氧化物中的O2-和NO两种自由基[45]。

2.7 唾液酸和透明质酸酶

透明质酸（HA）是葡萄糖醛酸和N-乙酰葡糖胺的线性重复，存在于各种动物部位，即鸡冠、眼睛、脐带、皮肤和软骨中[46]。透明质酸是高分子量分子，具有粘弹性能、高生物相容性，可以保持弹性和水分，减少炎症，润滑身体各个部位。此外，低分子量HA参与伤口愈合、血管生成、细胞分化、肿瘤细胞迁移和细胞凋亡[47-48]。一些细菌，包括链球菌属和P.multocida，会产生透明质酸作为其胶囊和黏液的组成部分[49]，唾液酸酶蛋白NanB和NanH可裂解宿主膜中的唾液酸，用作营养物质，并修饰细胞包膜逃避宿主免疫系统[5]。

3 结语与展望

多杀性巴氏杆菌的分型主要有3种，根据粉剂荚膜（A、B、D、E和F）的组成分为不同血清型。国外主要采用MLST分型方法，而且具有相应的数据库进行数据更新，更有利于病原追溯和物种进化分析，在研究多杀性巴氏杆菌流行病学方面具有优势。虽然研究学者已从多杀性巴氏杆菌的多方面开展了深入研究，但是畜禽养殖业疫苗缺乏的难题尚未解决。因此，研究学者可以将多杀性巴氏杆菌相关研究与该病原的疫苗研制和诊断试剂研发相结合，促进畜禽产业高质量发展。