小鼠感染副猪嗜血杆菌后肺组织中内质网应激信号通路相关基因的mRNA 表达情况

姜永针，杨海龙，郭悦怡，吴茜涵，吴延睿，张 晶

（武汉轻工大学动物科学与营养工程学院，湖北武汉 430023）

副猪嗜血杆菌（Glaesserella parasuis，Gps）是严重威胁猪群的重大细菌性病原之一。临床上常见于败血症和肺炎在内的多系统炎症，其中以格拉瑟氏病为典型特征。猪群中Gps 普遍存在且难以被净化，其发病率高，病情严重时病死率可达50%，给养猪业带来巨大经济损失。目前有关Gps 侵染肺部的研究主要集中在细菌毒力因子介导的免疫逃避，以及组织炎症和细胞自噬相关信号的调控。

近年来研究发现，内质网应激（ERS）可介导炎症反应。由于各种原因引起内质网中出现错误折叠与未折叠蛋白在腔内聚集而导致的内质网功能障碍，被称为内质网应激。为了缓解内质网应激，细胞会启动未折叠蛋白反应（UPR）保护机制，激活UPR 的三条信号通路（IRE1α 通路、PERK 通路和ATF6 通路）以调节内质网中蛋白折叠的压力，重建内质网稳态[3]。活性氧（ROS）、TLR 配体和一些细胞因子（IL-17 和TNF-α）已被证实可激活细胞内UPR 信号通路，触发细胞炎症和组织损伤。

目前，已有关于内质网应激在免疫应答、病毒/细菌感染、炎症等方面的研究报道，但在Gps 感染肺部过程中是否引发内质网应激尚未见报道。本试验利用副猪嗜血杆菌血清5 型感染昆明小鼠24 h 建立肺部炎症模型，再通过实时荧光定量PCR 方法检测Gps 感染后肺组织中炎性因子及内质网应激信号通路相关基因的变化情况，旨在初步探讨内质网应激在该感染过程中的潜在作用，为进一步深入了解Gps感染仔猪引发多系统炎症的机制提供新的研究方向。

2 材料与方法

2.1 细菌培养

将副猪嗜血杆菌（SH0165 菌株血清5 型）用0.005%NAD和5%胎牛血清的TSA固体培养基复苏，连续传代至第3 代；在无菌条件下挑取单菌落，加入含有0.005%和5%胎牛血清的TSB 液体培养基（5 mL）中，设置摇床37 ℃、180 r/min 培养10 ～12 h，将其作为种子液；然后将菌液按照2%接种量接种到相同的TSB 液体培养基中，摇床37℃、180r/min 培养10 ～12 h。

2.2 分组与接种

将昆明小鼠（采购自武汉逸挚生物科技有限公司，全雌性，6 周龄）20 只随机平分为2 组，实验组和对照组各10 只。实验组：每只小鼠腹腔注射5.5×109CFU 副猪嗜血杆菌0.2 mL；对照组：腹腔注射同等剂量生理盐水，观察24 h后杀鼠取样。

2.3 总RNA 提取及cDNA 合成

按照TRNzol Universal 总RNA 提取试剂说明书采用直接裂解法提取总RNA。采用Evo M-MLV反转录预混型试剂盒（湖南艾科瑞生物工程有限公司）进行反转录实验。

2.4 实时荧光定量PCR

实时荧光定量PCR 扩增体系（总体积为10 μL）如下：2× SYBR Green Pro Taq HS Premix 5 μL，RNase-free water 3.6 μL，cDNA 1 μL，上下游引物各0.2 μL。实时荧光定量PCR扩增程序设置为：95 ℃预变性30 sec；95 ℃变性5 sec，60 ℃退火和延伸30 sec，共40 个循环。实时荧光定量PCR的所有数据均采用2-△△Ct法进行比较分析。

2.5 数据统计分析

采用GraphPad Prism 9.0 软件进行统计学分析并进行绘图，在软件上采用t-test 进行组间差异分析，数据表示为（±s），P ＞0.05表示无显著性差异（ns），P ＜0.05 表示存在显著性差异（*），P ＜0.01 表示存在极显著差异（**），P ＜0.001 表示呈极显著差异（***）。

2 结果

2.1 感染Gps 后小鼠肺组织中炎性因子的表达变化

根据图1 的结果显示，与对照组相比，在Gps 感染24 h 后，小鼠肺组织中IL-6 与IL-1β的表达均上调了5 倍以上，同时TNF-α 的表达上调了2 倍以上，表明Gps 感染引发了小鼠肺部炎症反应。

图1 Gps 感染24 h 后，小鼠肺组织中炎性因子IL-6、IL-1β 和TNF-α 表达量的检测结果

2.2 感染Gps 后小鼠肺组织中内质网应激信号通路相关基因的表达变化

根据图2 的结果显示，与对照组相比，在Gps 感染24 h 后，小鼠肺组织中PERK、ATF6、IRE1、GRP78、ATF4、EIF2α、JNK、XBP1 和CHOP均显著上调（P ＜0.05），提示Gps 感染诱导了小鼠肺组织细胞中内质网应激的发生。另外，我们检测了细胞凋亡相关基因caspese-3、BCL-2和Bax 的表达变化，结果显示：与对照组相比，在Gps 感染24 h 后，小鼠肺组织中caspase-3与BAX 的表达显著上调，而BCL-2 的表达显著下调，提示Gps 感染诱导小鼠肺部组织中的细胞凋亡。

图2 Gps 感染24 h 后，小鼠肺组织中内质网应激信号通路相关基因及凋亡相关基因表达量的检测结果

3 讨论

研究已证实Gps 感染引发猪肺泡巨噬细胞的炎症反应。本试验检测了Gps 感染小鼠24 h 后肺组织中炎性因子IL-1β、IL-6 和TNF-α 基因的相对表达量，结果显示这三个炎性因子的mRNA表达量显著上调，说明Gps 感染小鼠肺部炎症模型构建成功。

目前研究已证实ERS 可调控多种细胞类型中的炎症通路，包括肝细胞、胶质细胞、β 细胞、巨噬细胞和肠上皮细胞。活性氧（ROS）、TLR配体和一些细胞因子（IL-17 和TNF-α）可激活UPR 中的IRE1α 与PERK，进一步加剧炎症。有文献表明，ERS 在D-GalN/LPS 诱导的急性肝衰竭小鼠模型中被激活，抑制ERS 可减少TNF-α和IL-1β 的表达，且减轻肝损伤。本试验研究发现Gps 感染小鼠24 h 后，肺组织中UPR 的三条信号通路中的关键基因均显著上调，提示Gps感染诱导细胞内质网应激的发生，可能进一步加强炎症反应。

此外，越来越多的研究发现，内质网应激和UPR 的激活与细胞凋亡密切相关。在内质网应激过程中，PERK 的激活导致EIF2α 的磷酸化，进一步促进转录因子ATF4 和促凋亡效应子CHOP 的表达。CHOP 在内质网应激引发的凋亡中起关键作用，它可以降低促凋亡BCL-2 的表达并增加Bax 的表达。Bcl-2 是一种抗凋亡蛋白，而Bax是一种促凋亡蛋白。在细胞内，Bcl-2 和Bax 之间的平衡是维持细胞生存和凋亡的重要因素。当Bcl-2 的表达相对较高时，它会抑制Bax 的活性，从而维持细胞的生存；相反，当Bax 相对较高时，它会抑制Bcl-2 的抑制作用，导致细胞凋亡。此外，IRE1 可以触发凋亡信号激活激酶-1（ASK1）的激活，从而激活下游激酶JNK，进一步抑制Bcl-2 和激活Bax。本试验研究发现，Gps 感染小鼠24 h 后，肺组织中促凋亡基因caspase-3与Bax 的表达显著上调，而抗凋亡基因BCL-2 的表达显著下调，提示小鼠肺组织中发生细胞凋亡且与内质网应激密切相关，但具体功能和调控机制仍不清楚，还需进一步研究。