甲基化酶WTAP通过调控FOXO1的表达参与肾缺血再灌注损伤

赵刚刚，李华锋，张鸿毅，肖克兵，杨 辉，李子峰，傅崇德

1西安医学院第一附属医院泌尿外科，陕西 西安 710000；2西安航天总医院泌尿外科，陕西 西安710100

急性肾损伤（AKI）是一种常见的肾功能突然丧失的临床综合症，表现为血清肌酐显著升高和尿量迅速减少，最终可逐渐发展为慢性肾病和终末期肾病，重症患者可导致死亡［1］。肾脏缺血再灌注损伤（I/RI）是导致AKI的主要原因之一，在过去的几十年里，有关肾脏的I/R损伤在该领域得到了广泛的研究［2］。然而，肾脏I/RI的发病机制十分复杂，尚未完全阐明［3,4］。因此，更为透彻地了解肾I/RI的病理生理反应对预防和治疗AKI具有重要的意义。

N6-甲基腺甘氨酸（m6A）是mRNA修饰物中含量最多的一种，存在于整个转录组四分之一的RNA中［5,6］，与各种生物过程有关如干细胞增殖与分化、心脏肥厚、DNA损伤和肿瘤发生等［7］，而这种RNA修饰在AKI和I/RI中的功能作用和调控机制研究较少。Wilms瘤1-相关蛋白（WTAP）是一种重要的m6A甲基化酶，可通过调节mRNA修饰来影响基因表达。WTAP在膀胱癌、急性髓系白血病等多种疾病中参与调控增殖、凋亡等过程［8,9］。值得注意的是，WTAP通过调节ATF4 mRNA的m6A修饰增加内质网应激，促进了心肌I/R损伤［10］，但WTAP在AKI和肾I/R损伤中的作用目前仍未见报道。

叉头蛋白O1（FOXO1）是叉头转录因子家族中的一员，在哺乳动物中广泛表达，具有调节细胞增殖、凋亡、自噬、氧化应激和能量代谢等功能［11］。FOXO1已被证明在肾I/R损伤中高表达，促进了线粒体相关的细胞凋亡，在维持肾小管上皮细胞线粒体功能发挥关键作用［12］。有关FOXO1的m6A修饰研究较少，有报道称METTL14通过增加FOXO1的m6A修饰加重内皮细胞炎症和动脉粥样硬化［13］。但FOXO1的m6A修饰在肾I/R损伤中的作用仍未见研究。

因此，本项目通过构建肾I/R损伤小鼠模型和缺氧/复氧（H/R）诱导的肾小管上皮细胞损伤模型，体内外探讨WTAP介导的m6A修饰在肾I/R损伤中的作用，并明确该作用是否与调控FOXO1表达有关，旨在为肾I/R损伤和AKI的防治提供新的分子靶点。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物和细胞 实验所用C57BL/6J小鼠购自空军军医大学动物实验中心；将6～8周龄小鼠常规条件下饲养，自由进食和饮水，实验前禁食12 h，自由饮水；所有动物实验经西安医学院第一附属医院伦理委员会批准（XYYFY2022LSDW-001），实验过程遵循“3R”原则；人肾小管上皮细胞（HK-2细胞）购自ATCC细胞库。

1.1.2 主要试剂和仪器 凋亡（TUNEL）检测试剂盒（南京诺唯赞医疗科技有限公司）；尿素氮（BUN）及血肌酐（Scr）试剂盒（南京建成科技有限公司）；m6A甲基化水平检测试剂盒（武汉艾美捷科技有限公司）；CCK-8试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；反转录试剂盒、SYBR Green混合液（TaKaRa）；蛋白裂解液和BCA蛋白定量检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；10%PAGE 凝胶剂盒（上海雅酶生物科技有限公司）；ECL 化学发光底物（西安米鼠生物科技有限公司）；m6A、WTAP、FOXO1、GAPDH 抗 体（ProteinTech）；LDH检测试剂盒（南京诺唯赞医疗科技有限公司）。小动物麻醉系统（瑞沃德生命科技有限公司）；全自动血生化分析仪（中山新锐医疗设备科技公司）；实时定量PCR仪（苏州雅睿生物技术有限公司）；化学发光机（北京赛智创业科技有限公司）；电泳仪、多功能酶标仪和凝胶成像分析仪（Bio-Rad）；倒置显微镜（上海维翰光电科技有限公司）；细胞培养箱（北京五洲东方科技发展有限公司）；厌氧箱（上海龙跃仪器设备有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 FOXO1 的甲基化位点预测 从NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）得到FOXO1的mRNA FASTA序列，将此序列复制到SRAMP（http://www.cuilab.cn/sramp/）网站“Predition”阅读框内，点击“submit”进行预测。

1.2.2 肾I/R损伤模型的构建 选取16只雄性C57BL/6J小鼠（6～8 周，体质量20～25 g），随机分为假手术组（Sham）和肾脏缺血再灌注损伤组（I/R），每组8只小鼠；所有小鼠在造模前12 h 禁饮禁食；术前先称量小鼠体质量，并进行记录；2%异氟烷麻醉（固定过程流量为3 L/min）；造模过程（1.5 L/min）进行麻醉，并行右肾切除术，然后用无损伤血管夹阻断左肾动静脉45 min，随后恢复左肾动静脉血流，建立肾脏缺血再灌注模型。整个建模过程中善待小鼠，熟练操作，最大限度减少对小鼠的伤害。

1.2.3 样本收集 造模后24 h，采用苯巴比妥钠腹腔注射麻醉，行腹部正中切口，切取左肾，将肾脏组织纵行剖开，一半放入4%多聚甲醛液中固定，另外一半再分成两份，一份用于组织染色使用，另一份放入冻存管中并放入液氮罐保存。取材时极尽小鼠最大科研价值，结束后立即用CO2安乐死的方式处死小鼠，减轻其痛苦。

1.2.4 肾功能检测 收集各组小鼠血液，分离血清后用根据试剂盒说明书，采用比色法，用全自动生化分析仪检测肌酐及尿素氮水平。

1.2.5 肾组织病理学检测 肾组织病理学检测取各组小鼠肾组织4%甲醛固定48 h后石蜡包埋制作切片，切片厚度大约为5 μm，进行HE染色，在200倍荧光显微镜下观察肾组织损伤情况。

1.2.6 免疫组织化学染色 包埋、切片和脱水同HE染色步骤。将3%双氧水滴加于切片上，37℃阻断内源性过氧化物酶20 min；流水冲洗20 min；将切片浸没在现配的柠檬酸钠中进行抗原修复（微波炉高火6 min；中高火13 min）；自然晾至室温；使用5%山羊血清室温封闭15 min；吸去多余血清，滴加一抗，室温过夜；PBS洗切片（3 次/5 min）；滴加二抗，37 ℃孵育40 min；PBS 洗切片（3次/5 min）；DAB显色液滴加于切片上（显色0.5～3 min）；镜下控制，着色深立即终止；流水冲洗10 min；苏木精染核3～5 min，自来水冲洗5 min；0.5%的盐酸酒精分化1 s，自来水冲洗2 min：1%氨水返蓝3 min，流水冲洗5 min；脱水封片步骤同HE染色，最后显微镜下拍照。

1.2.7 细胞凋亡染色 根据TUNEL 染色试剂盒说明书操作。4，6－二脒基－2－苯基吲哚二盐酸盐（DAPI）所染细胞核在紫外激发波下呈蓝色（即为视野所见所有肾小管上皮细胞），阳性凋亡细胞核为绿色。使用Eclipse Ci-L荧光拍照显微镜选取切片的目的区域进行200倍成像。成像完成后使用Image-Pro Plus 6.0分析软件，分别测量每张切片5个视野中阳性细胞数以及对应的总细胞数，并计算出阳性率（%）=阳性细胞数/总细胞数×100%。

1.2.8 qRT-PCR法检测mRNA水平 收集的组织/细胞用TRIZOL提取总RNA。TaKaRa反转录试剂盒反转录为cDNA；然后根据实时定量PCR试剂盒说明书配制PCR反应体系，程序为：95 ℃预变性30 s，（95 ℃变性5 s，60 ℃延伸30 s）×40个循环，GAPDH作为内参，2-△△Ct法计算基因表达水平。

1.2.9 Western blot法检测蛋白表达情况 RIPA裂解液提取总蛋白。BCA试剂盒定量蛋白浓度。上样进行聚丙烯酰氨凝胶电泳（80 V，30 min；120 V，60 min），300 mA电流转膜90 min，50 g/L脱脂牛奶封闭1 h。孵育相应一抗进行4 ℃过夜；TBST 清洗后，室温孵育二抗1 h；TBST清洗3次后进行显影并拍照。

1.2.10 HK-2细胞H/R模型构建和转染 人肾小管上皮细胞株（HK-2）细胞用新鲜的含10%FBS 的DMEM/F12（1∶1）完全培养基于37 ℃、5%CO2的细胞培养箱中进行培养，选对数生长期的细胞根据实验分组均匀铺板。

HK-2细胞H/R模型构建：细胞分为Control组和H/R组待细胞完全贴壁后，弃去培养液，加入不含FBS的无糖培养基，放入厌氧箱中缺氧24 h，除去细胞缺氧液，加入新鲜的DMEM/F12完全培养基于CO2细胞培养箱中复氧培养6 h。

细胞转染：细胞以5×104/孔铺于6 孔细胞培养板，待细胞贴壁长至70%左右时，换成无血清培养基，将Lipofectamine™2000 转染试剂和si-NC、si-WTAP干扰片段混匀静置5～10 min，将混合液体均匀加入每个孔中，4～6 h后进行换液，继续培养24、48 h后，收集细胞用于后续实验。

1.2.11 HK-2细胞活性检测 将各组细胞悬液分别接种于96孔板中，每孔中含5×103个细胞，培养2～4 h后，设空白孔（完全培基和CCK-8总体积110 μL）和对照孔（含正常培养细胞、完全培基和CCK-8，总体积110 μL），周边各孔加100 μL去离子水减少边缘效应，各组细胞均处理完成后，在各孔中斜贴培养板滴加CCK-8 溶液10 μL，然后于37 ℃、5%CO2的细胞培养箱内孵育1～4 h（根据显色情况调整时间），用酶标仪检测各孔的A450nm值判断细胞活性。

1.2.12 HK-2细胞培养液LDH释放水平检测 吸取各组细胞培养液500 μL，每组设置两组重复，全自动血生化仪进行检测。

1.2.13 Caspase3 活性检测 收集细胞样本后根据Abcam试剂盒说明书进行检测。

1.2.14 甲基化RNA免疫共沉淀后实时定量PCR（Me-RIP qPCR）RNA 提取试剂盒提取总RNA，PolyA mRNA 纯化试剂盒纯化提取的总RNA。将小鼠抗人m6A 抗体和IgG 的抗体分别添加到免疫共沉淀（IP）缓冲液中，并与蛋白质A/G 磁珠孵育1 h进行结合。然后将纯化的mRNA以及磁珠-抗体复合物加入到含有核糖核酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂的IP缓冲液中，于4℃下孵育过夜。将使用洗脱缓冲液洗脱下的RNA，用苯酚-氯仿法提取、纯化后，用实时定量PCR分析。

1.2.15 统计学分析 所有数据采用GraphPad Prism8.0.2软件进行统计分析，每种实验至少重复3 次，实验结果以均数±标准差表示，两组之间的比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠肾I/R损伤组织中WTAP的表达上调

全自动血生化分析仪检测了小鼠肾I/R损伤后的血清肌酐和血尿素氮的水平，与sham组相比，I/R组血清肌酐、尿素氮显著升高（P＜0.001，图1A、B）；HE染色结果显示，与sham组相比，I/R组肾组织产生病理性改变，表现为肾小球皱缩，肾小囊腔和肾小管腔扩张，上皮细胞肿胀坏死，细胞核缺失，细胞碎片堆积（图1C）；qRT-PCR 结果显示，与sham 组比较，I/R 组WTAP 的mRNA水平显著升高（P＜0.001，图1D）；Western blot结果显示，与sham组比较，I/R组WTAP蛋白的表达水平显著上升（P＜0.001，图1E）；IHC结果显示I/R后WTAP阳性面积显著增多（图1F）。

图1 WTAP在小鼠肾I/R损伤组织中的表达情况Fig.1 Expression of WTAP in mouse renal I/R injury tissues.A: Serum creatinine level in mice with renal I/R injury.B: Blood urea nitrogen level in mice with renal I/R injury.C: Pathological changes of the kidney in mice with renal I/R injury(HE staining,original magnification:×400).D:WTAP mRNA level in the kidney of mice with renal I/R injury.E:Changes of WTAP protein expression after renal I/R injury in mice.F:Expression of WTAP after renal I/R injury in mice(IHC,×200).***P＜0.001.

2.2 HK-2细胞H/R损伤后WTAP表达上调

CCK-8细胞活性检测结果显示，与Control组比较，H/R组细胞活性显著降低（P＜0.01，图2A）；全自动血生化仪检测了细胞培养液中LDH的释放水平，与Control组比较，H/R组LDH的释放水平显著降低（P＜0.001，图2B）；qRT-PCR检测了WTAP的mRNA水平，结果显示，与Control组比较，H/R组WTAP的mRNA水平显著升高（P＜0.001，图2C）；Western blot结果显示，与Control组比较，H/R 组WTAP 蛋白水平显著升高（P＜0.001，图2D）。

图2 WTAP在HK-2细胞H/R损伤中的表达情况Fig.2 Expression of WTAP in HK-2 cells with H/R injury.A:Changes of HK-2 cell viability after H/R injury.B:LDH release in HK-2 cells after H/R injury.C:WTAP mRNA level in HK-2 cells with H/R injury.D:Protein expression level of WTAP in HK-2 cells with H/R injury.**P＜0.01,***P＜0.001.

2.3 体外证明沉默WTAP对HK-2细胞H/R损伤作用的影响

通过转染siRNA对WTAP进行沉默，qRT-PCR鉴定干扰效果。与si-NC+H/R组相比，si-WTAP+H/R组WTAP的mRNA著降低（P＜0.0001，图3A）；与si-NC+H/R组相比，si-WTAP+H/R组WTAP蛋白水平显著降低（P＜0.0001，图3B、C）；细胞活性结果显示，与si-NC+H/R组相比，si-WTAP+H/R组细胞活性显著升高（P＜0.01，图3D）。TUNEL染色结果显示，与si-NC+H/R组相比，si-WTAP+H/R组细胞凋亡率显著降低（P＜0.01，图3E、F）；Caspase-3活性结果显示，与si-NC+H/R组相比，si-WTAP+H/R组Caspase-3活性显著降低（P＜0.001，图3G）。与si-NC+H/R组相比，si-WTAP+H/R组LDH释放水平显著降低（P＜0.001，图3H）。

图3 沉默WTAP对HK-2细胞H/R损伤的影响Fig.3 Effect of WTAP silencing on cell damage in HK-2 cells with H/R exposure.A:WTAP mRNAexpression level in HK-2 cells with H/R injury after WTAP silencing.B,C: Protein expression level of WTAP in HK-2 cells with H/R injury after WTAP silencing.D:Cell viability changes in HK-2 cells with H/R injury after WTAP silencing.E:TUNEL staining of HK-2 cells with H/R injury after WTAP silencing(×200).F:Statistical diagram of HK-2 cells with H/R injury by TUNEL staining after WTAP silencing.G:Changes of Caspase3 activity in HK-2 cell with H/R injury after WTAP silencing.H:LDH release in HK-2 cells with H/R injury after WTAP silencing.**P＜0.01,***P＜0.001,****P＜0.0001.

2.4 小鼠肾I/R 损伤组织和HK-2 细胞H/R 损伤中FOXO1 的mRNA和蛋白表达上调

与Sham组相比，在肾I/R损伤组织中，FOXO1的mRNA和蛋白的表达水平都显著升高（P＜0.001，图4A、B）；IHC 结果显示I/R 后，FOXO1 阳性面积较多（图4C）；与Control组相比，H/R组细胞中FOXO1的mRNA和蛋白的表达水平也显著升高（P＜0.001，图4D、E）。

图4 FOXO1在小鼠肾组织I/R损伤和HK-2细胞H/R损伤中的表达情况Fig.4 FOXO1 expression in renal tissue of mice with I/R injury and in HK-2 cells with H/R injury.A: FOXO1 mRNA level in mouse renal tissue.B:FOXO1 protein expression in mouse renal tissue.C:Expression of FOXO1 in mice after renal I/R injury(IHC,×400).D:FOXO1 mRNA level in HK-2 cells with H/R injury.E:Changes of FOXO1 protein expression in HK-2 cells with H/R injury.***P＜0.001,****P＜0.0001.

2.5 WTAP可直接作用于FOXO1 mRNA并与m6A调控有关

首先根据SRAMP（http://www.cuilab.cn/sramp/）网站预测可知，FOXO1具有多个m6A甲基化位点（图5A）。与si-NC+H/R组相比，si-WTAP+H/R组FOXO1 mRNA和蛋白水平都显著下降（P＜0.01图5B、C）；RIPqPCR 检测结果显示，与IgG 组相比，WTAP 抗体组FOXO1 的mRNA 水平显著上升（P＜0.05，图5D）；MeRIP-qPCR 结果显示，与si-NC+H/R 组相比，si-WTAP+H/R 组m6A-FOXO1 水平显著降低（P＜0.001，图5E）。

图5 WTAP通过FOXO1发挥作用及其m6A水平Fig.5 WTAP functions through FOXO1 and its m6A levels.A:Prediction of m6A modification site of FOXO1 using SRAMP.B:Changes of FOXO1 mRNA level after WTAP knockdown.C:Expression level of FOXO1 protein after WTAP knockdown.D:RIP experiment showing the interaction between WTAP and FOXO1.E:m6Alevel of FOXO1 detected by MeRIP-qPCR.**P＜0.01,***P＜0.001,****P＜0.0001.

3 讨论

RNA修饰是一类重要的表观遗传修饰，通过影响RNA的稳定性和翻译来调节基因表达［14-16］。RNA甲基化占所有RNA修饰的60%以上，包括m6A、m5C、m3U、m7G等，其中m6A修饰是mRNA中最常见的RNA甲基化类型［17-20］。WTAP 是m6A 修饰中的“阅读者”，和METTL3、METTL14都是重要的甲基转移酶［21］。I/R损伤发生在各种组织和器官中，包括心脏、肝脏、肺、肾脏、皮肤等［22-26］。有关I/R损伤的m6A修饰还未得到广泛的研究。Song等［27］证明m6A修饰与心肌I/R损伤的发病机制密切相关，在心肌I/R损伤小鼠中，METTL3蛋白的表达水平显著升高，心肌细胞活性显著降低；在新生儿心肌细胞的H/R损伤模型中，上调METTL3可降低自噬流，促进心肌细胞凋亡，而沉默METTL3可增强心肌细胞活力。m6A的甲基化调控也参与了肾I/R损伤的发生发展。Xu等［1］的研究证明低表达METTL14，小鼠肾组织和HK-2 细胞的I/R 损伤都被抑制，并与甲基化YAP1和YAP1-TEAD通路有关。WTAP在I/R损伤中的作用目前只在心肌中被研究，其在肾I/R损伤中是否发挥作用还处于未知阶段［10］。本研究发现，WTAP在小鼠肾I/R损伤和HK-2细胞H/R损伤中都高表达，提示WTAP 在肾缺血再灌注损伤中起促进作用。沉默WTAP后，与对照组相比，HK-2细胞活性增加，凋亡率降低，证明降低WTAP的表达可以减轻HK-2细胞的H/R损伤，可能通过凋亡通路发挥作用。

FOXO1作为一种重要的转录因子，是细胞代谢的关键调节者。已有多项研究证明FOXO1参与I/R损伤的进展［28］。FOXO1可促进脑I/R损伤的进展［29］；Wang等［12］发现FOXO1下调可抑制肾的I/R损伤；我们的研究结果也与此相一致，在小鼠肾I/R损伤和HK-2细胞的H/R 损伤中，FOXO1 的表达都显著升高，由此说明FOXO1的表达会加重肾I/R损伤。在缺血再灌注损伤诱导的急性肾损伤中不可避免地存在细胞凋亡。细胞凋亡是受多种基因调控的程序性细胞死亡；在凋亡信号调控下，线粒体膜电位之间的转运孔被打开，膜电位崩解，最终导致细胞凋亡［30］。大量研究表明，Caspases是参与调控细胞凋亡的重要蛋白［31］。当线粒体膜通透性改变时，启动Caspase 9的表达，Caspase 3作为最后的效应器元件被激活，Cleaved Caspase 3 是其活化形式，进入内源性凋亡通路，阻碍PARP 发挥正常功能，导致细胞凋亡［32］。Wang等［12］在HK-2细胞H/R损伤研究中，用FOXO1的抑制剂AS1842856进行预处理，结果显示与对照组相比，TUNEL 阳性染色的百分比降低，pro-Caspase3的裂解减少，说明FOXO1在HK-2细胞的H/R损伤中促进了细胞凋亡。本次研究结果显示，在小鼠肾I/R损伤后，TUNEL阳性肾小管上皮细胞数目增加，说明损伤后凋亡加重；同时，通过体外研究HK-2细胞的H/R 损伤，Caspase3 活性检测结果显示H/R 损伤后Caspase3活性显著增加，进一步证明了肾I/R损伤的机制与凋亡有关；以上研究结果与前人相一致，都证明了FOXO1在急性肾损伤中起促凋亡的作用。

m6A修饰在多种生物过程中发挥着重要作用，但有关FOXO1 这一重要转录因子的m6A 修饰研究甚少。目前相关学者报道了FOXO1的m6A修饰在内皮细胞炎症和动脉粥样硬化中的作用。内皮细胞炎症过程中，FOXO1的m6A修饰水平显著升高；METTL14敲低之后，FOXO1 的表达显著降低；MeRIP 实验证实METTL14可直接与FOXO1 mRNA结合，增加其m6A修饰，促进其表达，诱导内皮细胞炎症反应和动脉粥样硬化斑块形成［13］。虽然本研究采用SRAMP（http://www.cuilab.cn/sramp/）网站预测了FOXO1有多个高水平的m6A修饰位点，但仍需进一步的实验证明。通过MeRIP实验检测了HK-2细胞H/R损伤中，FOXO1的m6A修饰水平显著升高；沉默WTAP，FOXO1的m6A修饰水平显著降低。以上结果提示，WTAP可直接作用于FOXO1 mRNA，增加其m6A 修饰，调控其表达，诱导HK-2细胞凋亡。

综上所述，在I/R损伤的小鼠肾组织和H/R损伤的HK-2 细胞中，WTAP 和FOXO1 表达均上调；沉默WTAP可明显抑制和HK-2细胞的H/R损伤，其机制可能是沉默WTAP，减弱了FOXO1的m6A修饰，降低了FOXO1及凋亡相关蛋白的表达，从而抑制细胞凋亡，对肾I/R损伤起到保护作用。本研究证明WTAP-FOXO1可能成为治疗肾I/R损伤的潜在靶点，抵抗H/R损伤。但由于HK-2 细胞属于肾小管上皮细胞，WTAPFOXO1轴能否参与调控肾I/R损伤中其他类型细胞的功能，还需进一步探讨。