Box-Behnken响应面法结合多指标综合评分法对青钱柳提取工艺的优化研究*

张丹丹,李利华,杨玉莹,叶晓川**

(1.湖北科技学院糖尿病心脑血管病变湖北省重点实验室,湖北 咸宁 437100;2.湖北中医药大学药学院中药资源与中药化学省级重点实验室;3.湖北省中医院)

近年来,糖尿病的发病率逐年上升,WHO预测到2030年世界糖尿病发病率约为3.66亿人[1-2]。糖尿病并发症较多,严重危害人类健康,临床上抗糖尿病药物的长期使用会引起耐药性及副作用,因此,从中药或者天然药物中寻找疗效确切、副作用小的药物有很大的前景。

青钱柳Cyclocaryapaliurus(Batal.)Iljinsk.是国家重点保护的濒危植物之一[3]。现代药理研究发现[4],其具有降血糖、降血压等作用,近年来,民间及企业对青钱柳的需求量不断攀升,种植青钱柳成为贵州、广西等地脱贫攻坚的重点项目,青钱柳的总黄酮、总三萜及总多糖为其发挥药理作用的有效物质部分[4-8],但对该三类成分同时提取的工艺研究尚未见报道。本研究通过多指标综合评分法结合Box-Behnken响应面法优化青钱柳提取工艺,以期为青钱柳的新产品开发及临床应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 药物、试剂与仪器

芦丁(批号:100080-201408,中国食品药品检定研究院,纯度>98%);齐墩果酸(批号:R0160203,成都普思生物科技有限公司,纯度>98%);D-无水葡萄糖(批号:S08J6G1,上海源叶生物科技有限公司,纯度>98%)。

青钱柳药材为实验室自行采摘,产地为江西省修水县黄坳乡九龙山脉,经湖北中医药大学叶晓川教授鉴定为胡桃科植物青钱柳的干燥叶。药材粉碎(过2号筛),备用。

纯水仪(Milli-Q型,德国默克密理博公司);紫外可见光分光光度计(UV-1800,岛津企业管理有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 层次分析权数法确定各评价指标的权重系数

以指标性成分总三萜、总黄酮、总多糖三者提取率的总量对青钱柳的提取工艺进行评价。根据课题组前期的谱效关系研究得到总多糖、总黄酮、总三萜与降血糖总药效的关联系数分别为0.75、0.80、0.68,由其关联系数来确定层次分析矩阵,见表1。计算出总三萜、总黄酮、总多糖权重系数分别为:0.16、0.54、0.30。随机一致性比率CR=0.00458<0.1,故所得权重系数有效。

表1 层次分析矩阵

1.2.2 单因素实验

单因素考察的条件如表2,基于该结果,来确定响应面法选取的因素及水平范围为响应面法实验做准备,并根据权重系数来计算单因素实验的综合评分。

表2 单因素实验结果

(1)乙醇体积分数:取青钱柳粉末9份,每份1g,精密称定,分别用不同体积分数乙醇为提取溶媒,料液比1∶10,90℃下,提取2次,1h/次,滤过合并滤液,用相应的溶媒定容至100mL。

(2)料液比:取青钱柳粉末5份,每份1g,精密称定,以不同的料液比加入30%的乙醇,90℃下,提取2次,1h/次,滤过,合并滤液,并用相应的溶媒定容至100mL。

(3)提取次数:取青钱柳粉末3份,分别在料液比1∶10、90℃条件下用30%的乙醇提取不同次数,1h/次,过滤,合并滤液,并用相应的溶媒定容至100mL。

(4)提取时间:取青钱柳粉末5份,在料液比1∶10、90℃下用30%的乙醇提取,在5个不同浸提时间下,每个时间条件各浸提2次,滤过,合并滤液,并用相应的溶媒定容至100mL。

(5)提取温度:取青钱柳粉末5份,料液比1∶10,30%乙醇提取,2次,1h/次,在5个不同提取温度下提取,滤过,合并滤液,并用相应的溶媒定容至100mL。

1.2.3 Box-Behnken响应面法优选青钱柳提取工艺

根据单因素试验结果,采用Design Expert 7.0软件设计实验,因素及水平表见表3,提取次数固定为3次。

表3 Box-Behnken设计的因素及水平

1.2.4 多糖的含量测定

取D-无水葡萄糖对照品2.35mg,精密称定,加蒸馏水定容到10mL,摇匀。精密量取对照品溶液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8mL,置试管中,分别加水至2mL,加5%的苯酚溶液1mL,摇匀,迅速加入浓硫酸5mL,摇匀,置40℃水浴保温20min,冷却至室温。以水为空白,照紫外-可见分光光度法(中国药典2015版通则0401),在490nm波长处测定吸光度,以吸光度为纵坐标,浓度为横坐标,绘制标准曲线。回归方程:Y=0.0411X+0.1631,R2=0.9926,表明D-无水葡萄糖对照品在2.94～23.50μg/mL的浓度范围内线性关系良好。

精密量取10mL样品,在水浴上挥干至无醇味,上D101大孔吸附树脂,用蒸馏水冲洗,得冲洗液,浓缩到一定体积,转移至50mL的量瓶中,加水至刻度,摇匀。精密量取2mL,照上述方法,测定吸光度,根据回归方程计算出供试品溶液中含D-无水葡萄糖的重量(μg)。

1.2.5 总黄酮的含量测定

取芦丁对照品2.80mg,精密称定,用甲醇定容到25mL,摇匀。精密量取对照品溶液0、0.8、1.6、2.4、3.2、4.0mL,分别置于10mL试管中,挥干溶剂,加1%三氯化铝甲醇溶液1mL,摇匀,甲醇定容至10mL,摇匀,放置15min,以相应试剂为空白,照紫外-可见分光光度法[5],在409.5nm波长处测定吸光度,以吸光度为纵坐标,浓度为横坐标,绘制标准曲线。回归方程:Y=0.031X-0.074,R2=0.9986,表明芦丁对照品在8.96～44.80μg/mL的浓度范围内线性关系良好。

精密量取供试品溶液0.2mL,照上述方法,测定吸光度,根据回归方程计算供试品溶液中芦丁的重量(μg)。

1.2.6 总三萜的含量测定

取齐墩果酸对照品3.28mg,精密称定,加5mL甲醇,摇匀。精密量取对照品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL,置于10mL试管中,挥干溶剂,放冷,精密加入新配置的5%香草醛-冰醋酸溶液0.5mL、高氯酸1.4mL,摇匀,70℃水浴加热15min,取出冷却至室温,乙酸乙酯定容至10mL,以相应试剂为空白,照紫外-可见分光光度法,在551.5nm波长处测定吸光度,以吸光度为纵坐标,浓度为横坐标,绘制标准曲线。回归方程为:Y=0.0132X+0.0367,R2=0.9965,表明齐墩果酸对照品在13.12～65.60μg/mL的浓度范围内线性关系良好。

精密量取供试品溶液0.2mL,照上述方法,测定吸光度,根据回归方程计算供试品溶液中齐墩果酸的重量(μg)。

2 结 果

2.1 单因素试验结果

以100g青钱柳中总多糖、总黄酮、总三萜的提取量为考察指标,进行单因素考察,结果见表2。在提取次数因素考察中,综合评分由次数的增加而增高,故固定次数为3次。试验因素水平见表3。

2.2 响应面法

2.2.1 模型的建立及显著性检验

根据单因素试验结果,以总多糖、总黄酮、总三萜提取量的综合评分为评价指标,进行四因素三水平响应面优化设计,结果见表4。

表4 Box-Behnken设计表及结果

分析表4中27个试验点的响应值,采用统计软件Design Expert 7.0进行多元回归分析,所得回归方程:Y=77.77+5.14X1+14.13X2+0.15X3+3.45X4+0.54X1X2-3.53X1X3-3.04X1X4+1.69X2X3-8.79X2X4+3.61X3X4-11.13X12-5.54X22-4.63X32-2.80X42,回归方程模型“P>F”小于0.05,说明未知因素对实验结果干扰小,拟合模型检验较显著(P<0.05)。由表5可知,4个因素对综合评分的影响顺序为X2>X1>X4>X3。

表5 响应面法方差分析结果

2.2.2 验证实验

根据回归模型,由统计软件对实验参数进一步优化最佳的提取工艺参数:乙醇体积分数43.46%,料液比1∶30,提取时间98.44min,温度60℃,在此最佳条件下的综合评分为91.18。根据实际情况确定最佳工艺参数为:乙醇体积分数45%,料液比1∶30,提取时间100min,温度60℃,提取次数3次,在此条件下进行3次验证实验,得到的综合评分别为91.49、89.13、90.96,平均值90.53,与预测值比较,其相对标准偏差为0.71%,说明该工艺参数准确、可靠,具有一定的实际指导意义,结果见表6。

表6 验证实验结果

3 讨 论

响应面分析法作为一种优化方法,建立的数学模型预测性好,采用综合评分筛选出相关性显著的因素,在最大程度上减小实验误差,被广泛应用于工艺参数的优化[9-10]。响应面法是在单因素实验的基础上得到合适的点,并从这些点中获得一个完整连续的面,进而筛选到最优值;因此,在响应面设计中,单因素实验中变量参数的选择非常重要。

根据总评分对单因素参数范围进行确定,当乙醇体积分数从60%升高到80%时,总评分变化不大,所以范围定在0%～60%;总评分随着料液比的增加而增高,所以范围定在10～30;总评分在60min时出现一次峰值,但又随着提取时间的增加而增高,所以提取时间定为60～180min;提取次数越高,总评分越高,在3次时,总评分最高,故定为提取3次;总评分在90℃时出现第一次峰值,在100℃时下降,为确定其在90℃～100℃中的变化情况,把提取温度定为60℃～100℃。得到最佳提取工艺:45%乙醇体积分数,料液比1∶30,100min,60℃,验证实验证明了工艺的可行性。综上所述,Box-Behnken响应面法结合多指标综合评分法可用于青钱柳的提取工艺优化,且所得最优提取工艺稳定、可行。

近年来,研究者分别采用响应面法对青钱柳的总多糖和黄酮进行了提取工艺的筛选[11-13],仅针对一种成分进行提取,而青钱柳发挥药效作用是总多糖、总黄酮及总三萜成分的共同作用,因此,本研究首次从多指标入手,计算综合评分来优化青钱柳的提取工艺,该实验结果为青钱柳的综合利用、产品开发奠定了基础。