大黄素甲醚悬浮剂高效液相色谱分析方法研究

马 臣，于福利，曹 宇

(陕西省农业检验检测中心，陕西 西安 710003)

1 前言

大黄素甲醚化学名称为1，8-二羟基-3-甲氧基-6-甲基蒽醌，分子式为C16H21O5，母药为黄色粉末或膏状，熔点203～207℃[1]。大黄素甲醚是从中草药蓼科植物大黄的根、茎中提取的一种植物源农药，属蒽醌类化合物。该成分是一种植物次生代谢产物，具有防治植物病害的作用。其作用机理主要为抑制细菌的糖及糖代谢中间产物的氧化、脱氢，抑制蛋白质和核酸的合成。室内活性测定和田间药效试验结果表明，对黄瓜白粉病有良好的抑制和防治效果[2]。本文介绍了一种用高效液相色谱法可简便、快速分离测定样品中大黄素甲醚，保留时间合理，精密度与准确度较高，且线性关系和特异性良好，可作为企业生产过程质量控制和质检机构质量检测的参考方法。

2 试验部分

2.1 试剂和溶液 甲醇：色谱纯；丙酮：色谱纯；水：超纯水；磷酸：分析纯；磷酸溶液：Ψ(磷酸：水)=5：1 000;大黄素甲醚标样:已知质量分数,ω≥99.2%;0.8%大黄素甲醚悬浮剂。

2.2 仪器 高效液相色谱仪:Agilent 1260,具有二极管阵列检测器和自动进样器;Agilent色谱工作站;Millipore超纯水制备系统;色谱柱:150 mm×4.6 mm(i.d.)不锈钢柱,内装ZORBAX SB-C18、5 μm填充物;恒温水浴锅。

2.3 液相色谱操作条件 流动相:Ψ(甲醇：磷酸溶液)=85：15,经滤膜过滤,并进行脱气;流量:1.0 mL/min;柱温:30℃;检测波长:225 nm;进样体积:5 μL;保留时间:大黄素甲醚约7.4 min。

上述液相色谱操作条件,系典型操作参数,可根据不同仪器特点,对给定的操作参数做适当调整,以期获得最佳效果。典型的大黄素甲醚的标样、样品色谱图(图1、2)。

2.4 测定步骤

2.4.1 标样溶液的配制 称取0.05 g(精确至0.000 1 g)大黄素甲醚标样于100 mL容量瓶中,加入70 mL丙酮,超声波振荡5 min,冷却至室温,用丙酮稀释至刻度并摇匀,用移液管移取上述溶液10.0 mL于50 mL容量瓶中,用甲醇定容至刻度,摇匀。

2.4.2 试样溶液的配制 称取含0.05 g(精确至0.000 1 g)大黄素甲醚的试样于100 mL容量瓶中,加入70 mL丙酮,超声波振荡5 min,冷却至室温,用丙酮稀释至刻度并摇匀,用移液管移取上述溶液10.0 mL于50 mL容量瓶中,用甲醇定容至刻度,摇匀,过滤。

2.4.3 测定 在上述操作条件下,待仪器基线稳定后,连续注入数针标样溶液,各针相对响应值变化<1.5%时,按照标样溶液、试样溶液、试样溶液、标样溶液的顺序进样测定。

2.4.4 计算 将测得的2针试样溶液及试样溶液前后2针标样溶液中大黄素甲醚的峰面积分别进行平均,按下式计算其质量分数(%):

式中:A1—标样溶液中大黄素甲醚峰面积的平均值;
A2—试样溶液中大黄素甲醚峰面积的平均值;
m1—标样的质量,g;
m2—试样的质量,g;
ω—标样中大黄素甲醚的质量分数,%。

3 结果分析

3.1 色谱条件选择 色谱柱选择常用的ZORBAX SB-C18反相柱。根据大黄素甲醚物化性质、溶剂的紫外吸收波长,选择丙酮作为溶剂溶解样品,并以甲醇和0.5%磷酸水溶液作为流动相。为了得到更好的分离效果和峰形,将流动相按不同比例在色谱柱上进行试验,随着甲醇比例的增加,保留时间减小,当甲醇与0.5%磷酸水溶液比例达到90：10时,有杂质峰干扰大黄素甲醚,峰纯度达不到试验要求,最终选择Ψ(甲醇： 0.5%磷酸水溶液)=85：15作为流动相,流速1.0 mL/min。该条件下,大黄素甲醚色谱峰峰形较好,与杂质能完全分离,具有良好的精密度和准确度(图3)。

3.2 检测波长的选择 大黄素甲醚的紫外光谱图(图4),从图中可以看到大黄素甲醚的最大吸收波长约在225 nm处,在该波长处灵敏度较高,干扰较少,能够满足分析的要求,故将检测波长确定为225 nm。

图4 大黄素甲醚的紫外光谱图

图5 大黄素甲醚线性关系图

3.3 分析方法的线性相关性试验 按标样溶液的制备方法配制5个不同浓度的有效成分线性相关溶液。在上述操作条件下,待仪器稳定后,按照STD1至STD5的顺序测定每个溶液中大黄素甲醚的峰面积,取2次测定的平均结果(表1)。以大黄素甲醚质量浓度为横坐标,峰面积为纵坐标绘制标准曲线,线性回归方程和相关系数为Y=159.36x+1 432.5,R2=0.999 9。

表1 我国现有登记防治油菜病虫草害的农药品种情况

3.4 分析方法的精密度试验 按上述色谱操作条件对同一样品平行5次进行测定,测得标准偏差为0.007 1;变异系数为1.7%。(表2)。

表2 分析方法的精密度试验结果

3.5 分析方法的准确度试验 从已知质量分数的样品中称取5个试样,分别加入一定量的大黄素甲醚标准物质,在上述色谱操作条件下进行分析,测得大黄素甲醚质量分数的平均回收率为99.89% (表3)。

表3 分析方法的准确度试验结果

3.6 方法特异性 本试验采用HPLC-DAD峰纯度分析法来鉴别大黄素甲醚。大黄素甲醚标样、0.8%大黄素甲醚悬浮剂中的大黄素甲醚HPLC-DAD峰纯度均>990,有效成分处无其它物质干扰,符合定量分析要求。峰纯度色谱图(图6、7)。

图6 大黄素甲醚标样HPLC-DAD峰纯度色谱图

4 结论

试验结果表明,本文建立的HPLC分析方法,保留时间合理,精密度与准确度较高,且线性关系和特异性良好,可快速分离测定样品中大黄素甲醚,符合农药产品的质量分析要求。本方法具有简便、快速、准确、分离效果好等特点,是一种比较实用的方法。