基于网络药理学与分子对接探讨山茱萸-菟丝子治疗认知障碍的作用机制

徐洁 ，陈竞纬

1.南京中医药大学，江苏 南京 210023；2.南京中医药大学附属苏州市中医医院，江苏 苏州 215009

认知障碍指各种原因导致的各种程度的认知功能损害，患者大脑中与学习记忆及思维判断有关的高级智能加工过程出现异常，从而引起学习、记忆障碍，同时伴有失语、失认、失行等改变[1]。其机制可能与脑灌注减少、动脉粥样硬化、淀粉样蛋白沉积及脑白质改变等多种机制有关[2]。古代医家多认为肾精亏虚、髓海不足为其主要病因，临床治疗以补肾填精益髓为主要原则。山茱萸-菟丝子是历代医家治疗认知障碍的常用补肾填精药对之一，山茱萸在《神农本草经》中被列为中品，药味酸、涩，微温，入肝、肾经。现代研究表明，山茱萸提取物可通过对大鼠海马神经元的保护作用改善认知障碍[3]。菟丝子具有补益肝肾、固精缩尿、明目、安胎、止泻等功效。《雷公炮炙药性解》认为该药“入肾精……久服强阴坚骨，驻颜明目轻身，令人多子”。刘海云等[4]研究表明，菟丝子提取物能显著提高脑和肝组织中ATP酶活力和过氧化氢酶活性，降低其过氧化脂质含量，从而改善衰老小鼠模型的学习记忆能力。课题组前期研究表明，含此药对的膏方可有效改善海马体齿状回区神经元数目下降，提高学习记忆功能中神经元突触长时程增强相关蛋白表达水平，从而改善老年自发性高血压大鼠的学习记忆功能[5]，但其更深一步的作用机制尚不清楚。

目前网络药理学在中药研究方面成果显著，通过构建网络预测药物潜在靶点与作用机制。因此，本研究采用网络药理学方法探讨山茱萸-菟丝子活性成分治疗认知障碍的作用机制，为后续研究提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 认知功能障碍疾病靶点获取

以“cognitive impairment”“mild cognitive impairment”“dementia”“Alzheimer's disease”为检索词，检索TTD数据库（http://db.idrblab.net/ttd/）、GeneCards数据库（https://www.genecards.org/）、OMIM数据库（https://omim.org/），设置属性为“Homo sapiens”，删除重复靶点，获得认知功能障碍疾病相关靶点。

1.2 山茱萸-菟丝子化学成分及对应靶点收集

检索TCMSP数据库（http://tcmspw.com/tcmsp.php）检索山茱萸、菟丝子的化学成分，以口服生物利用度（OB）≥30%且类药性（DL）≥0.18为条件，筛选活性成分。利用UniProt数据库（https://www.uniprot.org/）将活性成分作用靶点名称进行规范化处理。

1.3 作用靶点预测

使用R4.2.2软件将山茱萸-菟丝子活性成分靶点与认知功能障碍疾病靶点相映射，交集靶点即为山茱萸-菟丝子干预认知功能障碍的预测靶点。

1.4 “药物-活性成分-靶点”网络构建

运用perl5.36.0软件将山茱萸-菟丝子靶点与疾病靶点相映射，采用Cytoscape3.7.2软件将相关数据进行可视化处理，构建“药物-活性成分-靶点”网络。

1.5 蛋白相互作用网络构建

将交集靶点导入STRING11.5数据库（https://string-db.org/），设定生物种类为“Homo sapiens”且交互分数＞0.9，隐藏游离节点，构建靶点蛋白相互作用（PPI）网络，并下载.tsv格式文件。

1.6 核心靶点筛选

将“1.5”项下.tsv格式文件导入Cytoscape3.7.2软件，采用Network Analyzer工具进行网络拓扑分析，计算度中心性（DC）、中介中心性（BC）、紧密中心性（CC）、特征向量中心性（EC）、网络中心性（NC）和局部平均连通性（LAC）。根据度值由高到低排序，筛选数值大于中位数的节点，从而获得山茱萸-菟丝子治疗认知功能障碍的核心靶点。

1.7 GO功能和KEGG通路富集分析

运用R语言org.Hs.eg.db软件包对交集靶点进行基因ID转换，利用R语言clusterProfiler、org.Hs.eg.db、enrichplot、ggplot2、Pathview软件包进行GO功能和KEGG通路富集分析。

1.8 分子对接

根据获得的关键活性成分相关信息，通过PubChem数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）获取活性成分结构。在UniProt数据库获取核心靶点的相关信息，通过PDB数据库（http://www.rcsb.org/）下载大分子受体蛋白即核心靶点结构。采用PyMoL2.4.0软件将其去水、去杂质、去除配体后，保存为pdb格式文件，导入AutoDock1.5.6软件进行加氢、计算电荷等操作，导出为pdbqt格式。对配体分子进行位置调整，同时设定蛋白活性口袋。使用Vina1.1.2软件进行分子对接，并计算结合能。利用PyMoL2.4.0软件对分子对接结果进行结构处理和可视化，使用Ligplot+2.2.5软件进行相互作用力分析。

2 结果

2.1 认知功能障碍疾病靶点

经整合、去重后得到认知功能障碍疾病靶点12 187个。

2.2 山茱萸-菟丝子活性成分及对应靶点

获得山茱萸-菟丝子活性成分30个，其中山茱萸20个，菟丝子11个，β-谷甾醇为共有成分，见表1。获得202个活性成分作用靶点。

表1 山茱萸、菟丝子活性成分

2.3 山茱萸-菟丝子治疗认知功能障碍靶点预测

将202个山茱萸-菟丝子活性成分靶点与12 187个认知障碍靶点取交集，共得到184个山茱萸-菟丝子治疗认知障碍的潜在靶点。

2.4 “药物-活性成分-靶点”网络

采用Cytoscape3.7.2软件构建“药物-活性成分-靶点”网络，见图1，其中左侧节点表示中药成分，右侧节点表示靶点，节点越大，则与其他节点联系越紧密；边表示两节点间存在相互作用。山茱萸-菟丝子22个活性成分作用于184个靶点，其中quercetin（槲皮素）、tetrahydroalstonine（四氢鸭脚木碱）、kaempferol（山柰酚）等与靶点连线多，为关键核心成分。

图1 山茱萸-菟丝子治疗认知障碍“药物-活性成分-靶点”网络

2.5 靶点蛋白相互作用网络

山茱萸-菟丝子治疗认知障碍靶点PPI网络见图2，节点代表靶点蛋白，边代表靶点蛋白的关系，线条越多表示蛋白越重要，网络有145个节点，604条关系。

图2 山茱萸-菟丝子治疗认知障碍靶点PPI网络

2.6 核心靶点筛选

选择DC≥11（2倍中位数值）的节点作为候选靶点，对其网络进行提取分析，以BC≥20.18、CC≥0.57、EC≥0.15、LAC≥4.43、NC≥5.33为标准筛选出核心靶点13个（MAPK1、TP53、HSP90AA1、FOS、HIF1A等），见图3、表2。这些靶点可能是山茱萸-菟丝子治疗认知障碍的关键靶点。

表2 山茱萸-菟丝子治疗认知障碍核心靶点

2.7 GO功能和KEGG通路富集分析结果

以校正后P＜0.05为条件，得到GO条目2 678个，生物过程主要涉及对外来生物刺激的反应、对营养水平的反应、对脂多糖的反应、细胞对化学压力的反应、对氧化应激的反应等；细胞组分主要涉及膜筏、膜微域、膜小凹等；分子功能涉及核受体活性、配体激活的转录因子活性、DNA结合转录因子结合等。对P值最小的前10个条目进行可视化展示，见图4。

图4 山茱萸-菟丝子治疗认知障碍靶点GO富集分析

KEGG通路富集分析共得到179条（P＜0.05）信号通路，P值最小的前20条通路包括：脂质与动脉粥样硬化、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、PI3K-Akt通路、HIF-1信号通路等，见图5。

图5 山茱萸-菟丝子治疗认知障碍靶点KEGG富集分析

2.8 分子对接结果

选择PPI网络中DC值较高，且与疾病关系密切的靶点MAPK1（PDB-ID：2DKZ）、TP53（PDB-ID：1GZH）、HSP90AA1（PDB-ID：7DHG）、RELA（PDB-ID：2VGE）、FOS（PDB-ID：1A02）、MAPK14（PDB-ID：1KWP）、ESR1（PDB-ID：1ERE）、MYC（PDB-ID：1A93）、EGFR（PDB-ID：1IVO）、AKT1（PDB-ID：1H10）、NR3C1（PDB-ID：1M2Z）、HIF1A（PDB-ID：1H2K）、STAT1（PDB-ID：1BF5）作为受体，与其对应的活性成分作为配体，进行分子对接，对接后得到其结合能与结合位点。结合能越低则配体与受体结合活性越高，结合能力越强，结合能≤-5.0 kcal/mol时则成分与靶点有较好活性，结合能≤-7.0 kcal/mol时则结合活性强烈[6]。结果显示，关键活性成分与靶点结合能均≤-5.0 kcal/mol，其中结合能≤-7.0 kcal/mol的对接结果占53.8%，见表3。将分子对接结果导入Ligplot+软件，生成睫毛图，见图6。

图6 山茱萸-菟丝子关键活性成分与靶点蛋白分子对接模式

表3 山茱萸-菟丝子治疗认知障碍核心靶点与关键活性成分分子对接结合能

3 讨论

认知障碍可归属中医学“痴呆”“善忘”等范畴，其病变虽在脑，但从脏腑辨证来说，定位在肾。肾为先天之本，主骨生髓，肾精亏虚，脑髓不足，脑失所养是认知障碍的发病基础[7]。认知障碍病因复杂，预后不佳，受到越来越多的关注。山茱萸-菟丝子作为补肾填精的药对之一，广泛用于包括认知障碍在内的多个系统的疾病。丁月霞等[8]对物理性切断穹隆海马伞的大鼠进行研究，发现山茱萸可抑制脑内凋亡信号进一步激活，其效果与上调细胞凋亡抑制因子并下调细胞凋亡促进因子有关；赵倩等[9]研究表明，菟丝子可通过抑制淀粉样前体蛋白过度裂解、毒性β淀粉样蛋白过度堆积、Tau蛋白异常磷酸化，减少炎症因子表达、调节雌激素等方面干预认知障碍。

认知障碍涵盖轻度认知损害至痴呆的各个阶段[10]。本研究筛选山茱萸-菟丝子中关键活性成分及认知障碍的核心靶点，并进行分子对接。研究结果表明，作用靶点较多的活性成分为槲皮素、山柰酚、异鼠李素、四氢鸭脚木碱，山茱萸-菟丝子多从抗氧化应激、抗炎及免疫调节、糖脂调节等途径发挥神经保护作用，以治疗认知障碍。

与认知障碍相关的核心靶点中，MAPK1（丝裂原激活化蛋白激酶）、TP53（肿瘤蛋白p53）、HSP90AA1（热休克蛋白）、FOS、HIF1A（缺氧诱导因子）影响认知障碍的发生发展。

随着生物年龄的增长，脑部神经元数量逐年减少，根本原因为细胞凋亡反应的发生。MAPK通路是潜在的分子治疗靶点，其被广泛应用于神经系统疾病的机制研究。Deng等[11]研究发现，抑制MAPK1可有效减少海马细胞凋亡，改善认知功能障碍。研究显示，菟丝子总黄酮以时间和剂量依赖性活化MAPK通路，下调p-ERK和p-p38的同时上调雌二醇水平，从而减少氧化应激损伤[12]。陈晶晶[13]在人成骨肉瘤细胞MG63的实验中发现，雌二醇可促进成骨细胞HIF1A基因表达。TP53是目前发现的重要抑癌基因，主要参与细胞应激损伤后的应激反应，影响细胞增殖、分化和凋亡过程[14-15]。p53是细胞衰老的负性调节因子，与细胞周期、细胞凋亡、细胞衰老、细胞增殖分化、线粒体功能障碍、DNA结合和转录等重要的生物学功能密切相关，p53的激活可诱导细胞衰老，是细胞衰老的生物学标志[16]。近年研究发现，菟丝子提取物能依赖性抑制凋亡相关蛋白p53、Bax表达，对去血清和活性氧损伤等因素造成的细胞损伤有一定保护作用，并调节细胞氧化还原状态[17]。在利用山茱萸活性成分5-羟甲基糠醛对体外培养的海马神经细胞抗氧化作用及机制研究发现，5-羟甲基糠醛能够发挥抗氧化作用，抑制H2O2诱导的大鼠海马神经元凋亡，可能与其增加Bcl-2基因表达，降低p53、Bax和caspase-3基因表达有关[18]。氧化应激是导致衰老和认知障碍等多种神经退行性疾病发展的重要因素[19]，缺氧诱导因子（HIF-1）是一种对缺氧环境较为敏感，参与机体缺氧后信号调节通路的转录因子[20]。HIF-1由诱导型亚基（HIF-1α）和组成型亚基（HIF-1β）组成。HIF-1活性主要受HIF-1α亚基控制，当脑内缺血缺氧时，细胞内HIF-1α含量增加，从而激活下游有关缺氧耐受的调节通路[21]。现有研究表明，在缺血性脑卒中的梗死区及其周围可发现血管新生相关因子表达增高，新生血管增多，从而有助于机体产生内源性代偿及侧支循环，增加大脑缺血部位的血流灌注[22]。热休克蛋白也称热应激蛋白，在细胞生长、发育、分化、基因转录等方面发挥重要作用，主要是在应激状态下保护细胞生命活动所必需的蛋白质，维持细胞生存。Hu等[23]研究表明，HSP90AA1在病毒感染早期调节Akt-mTOR分子级联途径以激活自噬的机制。Park等[24]研究发现，HSP90AA1可激活VEGF信号通路，释放多种生长因子和细胞因子，刺激血管内皮细胞的增殖和迁移，促进血管生成，改善组织缺血缺氧。本研究预测山茱萸-菟丝子通过促进HSP90AA1，从而促进海马区新生血管生成，改善认知功能。研究表明，菟丝子水提取物可明显提高骨质疏松骨折大鼠组织中骨生长因子VEGF等表达水平[25]，但其对HSP90AA1的作用尚未见相关研究。来丽娜等[26]发现，山茱萸多糖可诱导热休克蛋白的产生，从而使心肌细胞耐受缺氧复氧损伤。张慧丹等[27]亦通过细胞实验发现，山茱萸多糖血清可通过调节HSP表达减轻细胞DNA损伤，从而发挥抗人胚肺二倍体成纤维细胞衰老的作用。FOS存在于海马组织，可对外界刺激迅速作出反应，Yap等[28]研究表明，FOS激活可能是巩固记忆的必要功能，促使神经元可以微调来自抑制性神经元的输入，从而形成具有协调活动的持久记忆网络。FOS蛋白表达与学习记忆有密切关系，正常情况下神经元细胞表达极低，缺氧缺血性脑损伤可诱导FOS蛋白表达，使FOS积累，说明缺血后神经元蛋白合成能力得到快速恢复[29]。范慧晗等[30]实验表明，山茱萸多糖及水煎剂可上调FOS mRNA水平，提高痴呆模型大鼠的学习记忆能力。

由此推论，山茱萸-菟丝子可通过调节MAPK1、TP53、HSP90AA1、FOS、HIF1A等基因表达治疗认知障碍。

通过KEGG通路富集分析和GO富集分析，山茱萸-菟丝子通过参与多种生物过程和调控多条信号通路影响认知障碍的进展，其中PI3K-Akt通路、HIF-1α/VEGF通路与认知障碍密切相关。PI3K-Akt信号通路广泛存在于各种细胞中，是神经存活信号转导的主要途径之一，是经典的抗凋亡、促存活的信号转导通路，也是调节大脑认知功能的关键信号通路。刘玥欣[31]通过对相关文献进行综述，发现多数轻度认知功能障碍患者因脑内PI3K-Akt信号通路受到抑制，进而引发神经细胞凋亡，影响记忆功能，通过激活PI3K-Akt信号通路，抑制神经细胞凋亡、改善能量代谢、促进神经功能恢复，有效保护大脑正常生理功能。缺血缺氧是导致认知障碍的主要原因，缺血缺氧通过破坏神经生长发育甚至使其凋亡坏死而改变海马区的功能，最终导致认知能力持续性下降。HIF1可激活VEGF/VEGFR-2通路，使血管通透性升高，诱导内皮细胞迁移增殖，为血管再生及渗透做准备。通过对HIF-1α/VEGF信号通路的促进，可促使血管新生及脉管网络成熟，改善脑内微循环，抑制神经元凋亡，进而起到神经保护的作用。

分子对接结果显示，结合能均＜-5.0 kcal/mol，表明活性成分与蛋白有较好的结合活性。其中槲皮素与HSP90AA1、FOS、EGFR、HIF1A，山柰酚与HSP90AA1，异鼠李素与HSP90AA1、MAPK14、ESR1，四氢鸭脚木碱与NR3C1，β-谷甾醇与HSP90AA1之间结合能≤-7.0 kcal/mol，表明这些活性成分在治疗认知障碍中具有重要的药理作用，可对其进行深入研究。

本研究尚存在一定局限性：仅从网络药理学角度发掘山茱萸-菟丝子治疗认知障碍的机制，缺少实验验证；山茱萸-菟丝子在不同复方中作用和功效不同，药对有效成分并不能完全代表复方的有效成分和作用。

综上所述，本研究利用网络药理学及分子对接技术，探讨了山茱萸-菟丝子治疗认知障碍的活性成分、核心靶点及分子作用机制。山茱萸-菟丝子治疗认知障碍通过槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、异鼠李素、豆甾醇、四氢鸭脚木碱等多种成分作用于MAPK1、TP53、HSP90AA1、FOS、HIF1A等多个靶点，从而影响PI3K-Akt通路、HIF-1α/VEGF通路等多条相关通路发挥作用，为进一步研究中药治疗认知障碍的机制提供了分子基础。