基于网络药理学探讨散结通脉方化裁方治疗动脉粥样硬化作用机制

邱萌萌 ，李双娣

1.长春中医药大学，吉林 长春 130117；2.长春中医药大学附属医院，吉林 长春 130021

随着社会经济发展加快，工作、生活方式以及饮食结构改变，我国心血管疾病病死率逐年攀升，居各疾病死亡原因之首，占居民疾病病死率40%以上[1]。动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是多种心血管疾病共同的病理表现，可继发心肌缺血、心肌梗死、血栓，血栓脱落会引起急性心血管事件。西医根据其发病机制有相应的治疗方法，但仍存在较多严重的不良反应[2-3]，如服用阿司匹林造成出血、痛风，服用他汀类药物引发肌病、肝肾功能损害、糖代谢异常等，中医药治疗在减轻西药不良反应上有一定优势。

AS属中医学“胸痹”“心痛”“心悸”等范畴，《素问·藏气法时论篇》云：“心病者，胸中痛，胁支满，胸背肩胛间痛，两臂内痛。”中医病因学说认为，痰浊血瘀是AS发生发展过程中重要的病理因素。正所谓“心痹之因……痰凝血滞”（《证因脉治》）“心痹痛者……素有顽痰死血”（《古今医鉴》）。有研究表明，痰浊与血脂具有一定相似性[4]，痰浊证型与高脂血症、动脉粥样硬化紧密相关。痰浊日久阻滞气机，气行不畅引起血瘀，痰瘀胶着形成新的病理产物，进一步影响心脉畅通，进而形成恶性循环。《景岳全书》指出“津凝血败，皆化为痰”，《血证论》指出“血积既久，亦能化为痰水”，痰瘀2种病理产物相互转化、互为根本的认识由来已久。散结通脉方化裁方是长春中医药大学附属医院全国首届名中医黄永生教授经多年临床观察总结而成，方剂由丹参、三七、茵陈、茯苓、泽泻5味药物组成，具有利湿化痰、化瘀通络功效，经过数十年临床实践和实验研究表明，该方具有抗AS作用，在稳定及减小斑块方面有突出效果[5-6]。

中医药在治疗过程中，以辨证论治原则为依据，以病因病机为基础，对病变进行整体治疗。这种系统调控的思想，与网络药理学研究思路有相似之处。本文基于中药作用的基本特点，利用网络药理学方法，对散结通脉方化裁方治疗AS的机制进行预测分析，为散结通脉方化裁方深入开展实验研究和临床应用提供依据。

1 资料与方法

1.1 药物活性成分及靶点获取

将散结通脉方化裁方中的丹参、三七、茵陈、茯苓、泽泻中药名称分别输入TCMSP（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）进行初步筛选，获得各个药物的主要成分，并以口服生物利用度（OB）≥30%、类药性（DL）≥0.18为限定条件对所收集到的成分进行筛选。查找成分对应的靶点，建立“散结通脉方化裁方成分-靶点”数据库。将获得的相关靶点输入UniProt（https://www.uniprot.org/）数据库中，以校正靶点名称。

1.2 疾病靶点及交集靶点获取

以“Atherosclerosis”为关键词检索GeneCards数据库（https://www.genecards.org/）、OMIM数据库（https://www.omim.org/）与DrugBank数据库（https://www.drugbank.ca/），选取靶点与疾病相关性（Score_gda）平均值在0.040 1以上的靶点，以保证研究的准确性。下载后对3个数据库结果进行合并，去除重复靶点。取药物靶点与疾病靶点交集映射，绘制韦恩图（https://www.baidu.com/s?ie=utf-8&tn=88093251_25_hao_pg&word=veen），获得散结通脉方化裁方治疗AS的潜在靶点。

1.3 散结通脉方化裁方治疗动脉粥样硬化“药物-成分-靶点”网络构建

使用Excel2010软件VLOOKUP函数将上述潜在靶点与TCMSP数据库检索结果中的活性成分相对应，整理为Network表格，并绘制属性表格上传至Cytoscape3.7.2软件（http://cytoscape.org/）进行可视化分析，构建散结通脉方化裁方治疗AS“药物-成分-靶点”网络。

1.4 蛋白相互作用网络构建

将获取的交集靶点导入STRING在线平台（https://string-db.org/），设置物种为“Homo sapiens”，最低相互作用阈值为“high confidence（0.400）”，并潜藏游离靶点，其余参数保持默认值，获取蛋白相互作用（PPI）信息数据列表，保存为TSV格式并构建PPI网络[7]。再将获得的相互作用蛋白质基因上传到Cytoscape3.7.2软件进行网络拓扑学分析，将度值（Degree）、中介中心性和紧密中心性均不低于其平均值的靶点作为散结通脉方化裁方治疗AS的关键靶点，同时构建网络结构图。

1.5 GO功能与KEGG通路富集分析

将交集靶点导入在线软件DAVID（https://david.ncifcrf.gov/）中，设置物种为“Homo sapiens”，选择P＜0.05，通过选择GO Biological Processes、GO Molecular Functions、GO Cellular Components、KEGG Pathway进行GO功能和KEGG通路富集分析。获得散结通脉方化裁方治疗AS的生物过程（BP）、细胞组分（CC）、分子功能（MF）和相关信号通路信息，并绘制富集分析气泡图和可视化网络。

1.6 “药物-活性成分-靶点-通路”网络构建

将相互对应的药物、成分、靶蛋白和通路数据上传至Cytoscape3.7.2软件，构建“药物-活性成分-靶点-通路”网络。

2 结果

2.1 活性成分及靶点

共得到733个药物活性成分，去重后得到药物活性成分85个；对应靶点648个，去重后得到靶点227个。散结通脉方化裁方活性成分及靶点信息见本文OSID码。

2.2 疾病靶点和交集靶点

对GeneCards、OMIM、DrugBank数据库收集的疾病靶点进行合并，去除重复靶点，共检索到AS对应靶点1 439个。运用Venny2.1.0绘图网站对227个药物活性成分对应靶点与1 439个疾病相关靶点取交集映射，共得到131个交集靶点。

2.3 散结通脉化裁方治疗动脉粥样硬化“药物-成分-靶点”网络

将交集靶点、活性成分、中药导入Cytoscape3.7.2软件进行可视化处理，获得散结通脉化裁方治疗AS“药物-成分-靶点”网络，见图1。网络共有5个中药节点、85个活性成分节点和131个交集靶点节点。

2.4 蛋白相互作用网络

将交集靶点结果输入STRING数据库，设置Multiple proteins、Homo sapiens构建PPI网络，见图2。该网络包含131个节点和2 571条边。利用Cytoscape插件CytoHubba的MCC、DMNC、MNC、Degree、EPC、BottleNeck、EcCenTricity、Closeness、Radiality、Betweenness、Stress、Clustering Coefficient12种算法计算，得到散结通脉化裁方治疗AS关键靶点，见图3。

图2 散结通脉方化裁方治疗AS交集靶点PPI网络

图3 散结通脉方化裁方治疗AS关键靶点PPI网络

2.5 GO功能和KEGG通路富集分析结果

将散结通脉方化裁方治疗AS潜在靶点上传至DAVID数据库进行GO功能和KEGG通路分析。共得到631条BP富集结果，主要涉及RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控（positive regulation of transcription from RNA polymerase Ⅱ promoter）、以DNA为模板的转录正调控（positive regulation of transcription,DNAtemplated）、基因表达的正调控（positive regulation of gene expression）、对药物的反应（response to drug）、细胞对缺氧的反应（cellular response to hypoxia）、凋亡过程（apoptotic process）、炎症反应（inflammatory response）等；得到61条CC富集结果，涉及核质、细胞外间隙、细胞外区、大分子复合物、染色质等；得到104条MF富集结果，涉及蛋白质结合、相同的蛋白质结合、酶结合、转录因子活性、序列特异性DNA结合、蛋白质同源二聚活性等。

KEGG富集到癌症的通路、脂质与动脉粥样硬化、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、PI3K-Akt信号通路、流体切应力和动脉粥样硬化等153条信号通路。分别将排名前10位的GO条目和前20位KEGG通路富集结果按P值由小到大排序绘制成柱状图及气泡图，见图4、图5。

图4 散结通脉方化裁方治疗AS靶点GO富集分析

图5 散结通脉方化裁方治疗AS靶点KEGG通路富集分析

2.6 “药物-活性成分-靶点-通路”网络

该网络图中包括4个药材节点、67个关键成分节点、20个关键靶蛋白节点和20条通路节点，共111个节点，见图6。由网络图分析结果可知，有效成分中连接边数较多的为槲皮素、木犀草素、人参皂苷Rh2、丹参酮ⅡA、隐丹参酮等；潜在靶点连接较多边数的为PTGS2、AKT1、CASP3、JUN、VEGFA等；通路中糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、癌症的途径、IL-17信号通路、脂质与动脉粥样硬化、流体切应力和动脉粥样硬化等与潜在靶点有较多连接。

图6 散结通脉方化裁方治疗AS “药物-活性成分-靶点-通路”网络

3 讨论

黄永生教授认为，痰浊与瘀血相互胶结是AS斑块形成的主要原因，基于古人对痰瘀相互转化的认识，黄老提出“瘀能化水”理论，即在AS治疗过程中循环使用“化”法（即活血化瘀法）与“清”法（即软坚化痰、行气散结法），使血脉内胶结的有形物质由瘀转化为痰，进而化为水排出体外，以恢复血脉通畅[8]，从而拟定散结通脉化裁方。该方不仅可以稳定AS斑块，甚至可逆转AS斑块，具有较大的研究价值[9]。

本研究共筛选出散结通脉方化裁方活性成分85个，对应靶点227个，治疗AS的直接靶点1 439个，相关生物过程631条、细胞组分61条、分子功能104条。通过分析图1发现，散结通脉方化裁方治疗AS的主要成分是槲皮素、木犀草素、人参皂苷Rh2、丹参酮ⅡA、隐丹参酮等。其中槲皮素药理作用广泛，具有扩张冠状动脉、降血脂、抗血小板凝集、抗糖尿病并发症等多方面作用[10]。另有报道显示，合成的槲皮素氧乙酸赖氨酸盐水溶性强，用于治疗出血性疾病、循环障碍、AS等具有较好的疗效[11]。木犀草素是天然的类黄酮化合物，据报道，其具有抗氧化、抗微生物、抗炎、化学预防、治疗、心脏保护、抗糖尿病、神经保护和抗过敏的特性[12]。有研究发现，人参皂苷Rh2可改善高脂大鼠氧化应激与炎症水平，增加大鼠心肌缺血再灌注后外周血内皮祖细胞数量，从而保护受损心肌[13]。丹参酮ⅡA有保护血管作用，不仅能改善血液流变学及血小板功能[14]，减少动脉粥样硬化斑块和血栓生成，降低细胞毒性T细胞、T调节细胞、低密度胆固醇等水平，提高高密度脂蛋白胆固醇水平，减少AS斑块面积[15]，还可保护心肌细胞。有实验表明，丹参酮ⅡA可能通过激活Notch1通路改善MI大鼠心脏功能、调控心肌细胞自噬[16]。隐丹参酮可以降低内皮细胞通透性，导致血清促炎介质显著减少，而不改变血脂谱。Liu等[17]研究发现，通过抑制凝集素样氧化低密度脂蛋白受体-1和基质金属蛋白酶-9的表达，以及抑制活性氧生成和核因子κB的激活，减小ApoE-/-小鼠AS斑块面积，降低斑块脱落的危险性。通过药理学研究发现，散结通脉方化裁方的主要成分在抗氧化、降脂、抗血小板、抗AS等方面发挥了一定作用。

PPI网络拓扑学分析显示，VEGFA、AKT1、STAT3、TNF、IL6等为散结通脉方化裁方治疗AS的关键靶点。VEGFA在血管生成和内皮细胞生长中发挥重要作用，能诱导内皮细胞增殖、促进细胞迁移、抑制细胞凋亡并诱导血管通透性等[18]。AKT1是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶之一[19]，通过参与多个炎症、免疫、代谢和细胞增殖相关的信号通路对相关生物学过程进行调节。STAT3是炎症反应的调节因子，通过活化T细胞、促进B细胞增殖和分泌抗体、激活巨噬细胞等参与免疫、炎症的调节。TNF不仅可调节免疫功能，而且可作用于血管内皮细胞，损伤内皮细胞导致血管功能紊乱，使血管损伤和血栓形成[20]。IL6是一种炎症性细胞因子，在炎症反应、血栓形成、调节血管壁细胞增殖和促细胞凋亡中发挥作用，对心肌收缩功能和中性粒细胞黏附有直接影响，与缺血再灌注导致的心肌细胞损伤密切相关[21-22]。同时也是脂质代谢平衡的关键调节器[23]。

通路富集分析显示，散结通脉方化裁方可能通过干预糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、癌症的途径、IL-17信号通路、脂质与动脉粥样硬化、流体切应力和动脉粥样硬化等多条通路治疗AS。前期实验研究表明，散结通脉方化裁方不仅改善血清炎症因子及血脂水平，还可逆转和消退AS斑块[9]。

综上所述，散结通脉方化裁方可能通过槲皮素、木犀草素、人参皂苷Rh2、丹参酮ⅡA、隐丹参酮等作用于PTGS2、AKT1、VEGFA、STAT3、TNF等靶点，涉及糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、癌症的途径、IL-17信号通路、脂质与AS、流体切应力和AS等通路。本研究表明，散结通脉方化裁方治疗AS有多成分、多靶点、多通路的特点。但网络药理学的结果仅提示散结通脉方化裁方与AS的相关性，故在进行通路富集后，仍需进行实验来验证通路上下游关键蛋白的表达水平，为后续深入研究AS的机制和中医药治疗手段提供参考。