基于网络药理学和分子对接探讨归脾汤治疗免疫性血小板减少症作用机制

谷文琪，杨濛，2，翟文生，2，宋纯东，2，吴静静，2，张蒙蒙，刘丽雅，2，李鹏飞，2，张秋月，2，段永悦，丁梦圆

1.河南中医药大学儿科医学院，河南 郑州 450046；2.河南中医药大学第一附属医院，河南 郑州 450003

免疫性血小板减少症（immune thrombocytopenia，ITP）是一种自发性出血性疾病，以无明确原因导致的孤立性外周血血小板数量减少为主要特征，每年发病率约为1.1/10万～5.8/10万[1-2]，儿童发病率较高。ITP发病机制尚不清楚，研究表明可能与T细胞活化的相关基因或细胞因子相关的单核苷酸多态性（SNP）有关，该病特征表现与受损的T细胞和B细胞相关自身反应性抗体有关[3]。ITP临床治疗常用泼尼松、地塞米松等药物，2021版指南建议对于0～2级出血患者选择常规剂量短疗程中效糖皮质激素[4]，但长期使用易导致“满月脸”、高血压及骨质疏松等不良反应，中药可有效治疗ITP且不良反应少[5]。

ITP属中医学“血症”“葡萄疫”“虚劳”等范畴，命名为“紫癜病”[6]。《外科正宗·葡萄疫》言：“葡萄疫，其患多生小儿，感受四时不正之气，郁于皮肤不散，结成小大青紫斑点，色若葡萄，发在遍体头面，乃为腑症；自无表里，邪毒传胃，牙龈出血，久则虚人，斑渐方退。”指出儿童ITP多因外邪或邪毒内侵诱发，且病久则虚。因小儿独特的生理病理特点，患儿病情易反复伤中，致脾气虚弱，心气不足，气不摄血，多见气不摄血型ITP，治法当益气健脾，养血生血，方选归脾汤以健脾养心、益气摄血。该方原载于《济生方》，后至《正体类要》补充当归和远志两味药，全方增至12味中药。现代研究发现，归脾汤可以抑制NF-κB p65磷酸化和IDO表达，促进M2型巨噬细胞极化，从而获得较好的临床疗效，还可降低脾脏中CD80和CD86表达，抑制B淋巴细胞活化，减少血小板自身抗体产生，进而保护血小板[7-8]。中药复方具有多成分、多途径、多靶点协同作用的特点[9]，本文基于网络药理学和分子对接的研究方法，探讨归脾汤治疗ITP的作用机制，为其临床应用及深入研究提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 活性成分及靶点获取

运用TCMSP（https://tcmspw.com/tcmsp.php）、TCMIP（http://www.tcmip.cn/）、BATMAN（http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）数据库筛选白术、人参、黄芪、当归、甘草、茯苓、远志、酸枣仁、木香、生姜、大枣、龙眼肉12味中药活性成分，并通过收集文献，补充数据库中收录活性成分较少的中药，设定条件口服生物利用度（OB）≥30%，类药性（DL）≥0.18%。通过TCMSP数据库获取活性成分作用靶点，并利用UniProt数据库（https://www.uniprot.org/）进行标准化。

1.2 疾病靶点获取

通过GeneCards（https://www.genecards.org/）、TTD（http://db.idrblab.net/ttd/）、OMIM（https://omim.org/）数据库检索“immune thrombocytopenia”“idiopathic thrombocytopenic purpura”，合并结果去除重复项获取ITP相关靶点。将活性成分作用靶点与疾病靶点上传jvenn平台（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）生成韦恩图，取交集即为归脾汤治疗ITP关键靶点。

1.3 “活性成分-靶点”网络构建

利用Cytoscape3.8.2软件构建归脾汤“活性成分-靶点”网络，并运用Analyze Network功能进行网络特征分析，通过分析度值（Degree）、边、紧密度（Closeness）等指标，筛选归脾汤关键活性成分与作用靶点。

1.4 “药物-活性成分-靶点-疾病”网络构建

通过Cytoscape3.8.2软件将归脾汤组方药物活性成分、靶点及疾病可视化并进行网络特征分析，筛选归脾汤治疗ITP的关键活性成分与关键靶点。

1.5 蛋白互相作用网络构建

将作用靶点导入STRING平台（hppts://srting-db.org/）构建蛋白相互作用（PPI）网络，物种选定为“Homo sapiens”，中等置信度（medium confidence）设置0.400，其余条件保持默认设定，获得PPI网络。进一步将TSV数据结果导入Cytoscape3.8.2，使用CytoHubba插件，依据Degree值筛选前20位核心靶点。

1.6 GO功能和KEGG通路富集分析

将关键靶点输入DAVID6.8数据库（https://david.ncifcrf.gov）功能注释栏，物种设定为人类，进行GO功能和KEGG通路富集分析。利用R语言将结果可视化。

1.7 分子对接验证

选取归脾汤“活性成分-靶点”与“药物-活性成分-靶点-疾病”网络中重复且Degree值前5位核心活性成分，与前5位核心靶点进行分子对接。首先利用TCMSP数据库获取活性成分mol2结构，PDB数据库（https://www.rcsb.org/）获取核心靶点蛋白3D结构，然后通过PyMoL软件对蛋白结构去配体，再使用AutoDock软件去水、加氢，进行分子对接，最后选择结合能与均方根偏差（RMSD）最佳的5组进行可视化。

2 结果

2.1 药物活性成分靶点预测结果

通过数据库筛选和文献[10]补充，共得活性成分黄芪20个、白术7个、人参22个、当归2个、甘草92个、茯苓15个、酸枣仁9个、木香6个、生姜5个、大枣29个、远志29个、龙眼肉3个，经删除重复项后得到214个活性成分，进一步剔除无靶点的活性成分后保留175个。预测作用靶点3 369个，删除重复项后保留491个作用靶点。

2.2 疾病靶点获取及靶点筛选

通过GeneCards、TTD、OMIM数据库检索获取ITP相关靶点4 193个，合并删除重复项后共1 133个。进一步利用jvenn平台获得归脾汤治疗ITP潜在靶点110个。

2.3 归脾汤“活性成分-靶点”网络

归脾汤“活性成分-靶点”网络见图1，共包括671个节点，3 628条边，节点大小代表Degree大小，节点间连线代表相互作用。经网络特征分析后得出节点较大的活性成分为槲皮素（quercetin）、山柰酚（kaempferol）、豆甾醇（stigmasterol）、β-谷甾醇（beta-sitosterol）、异鼠李素（isorhamnetin）、刺芒柄花素（formononetin）、S-（2-羧乙基）-L-半胱氨酸（S-（2-carboxyethyl）-L-cysteine）、毛蕊异黄酮（calycosin）、常春藤皂苷元（hederagenin）、原阿片碱（fumarine），这些活性成分Degree值较大，连接线较多，可能在归脾汤治疗ITP中起到关键作用；Degree值前5位靶点为PTGS2、HSP90AA1、AR、ESR1、PTGS1，可能是归脾汤治疗ITP的关键靶点。

图1 归脾汤“活性成分-靶点”网络

2.4 归脾汤“药物-活性成分-靶点-疾病”网络

归脾汤治疗ITP“药物-活性成分-靶点-疾病”网络见图2，共有298个节点，1 164条边，节点大小代表Degree值大小，节点间连线则代表相互作用，经网络特征分析，Degree值较大的靶点是PTGS2、HSP90AA1、NOS2、PPARG、F10、MAPK14、ADRB2、DPP4、F2、F7，靶点与活性成分、疾病之间连线较多，可能为归脾汤治疗ITP的关键靶点。

图2 归脾汤“药物-活性成分-靶点-疾病”网络

2.5 蛋白互相作用网络及核心靶点筛选

PPI网络共有109个节点，2 209条相互作用线，平均节点度40.05，聚类系数0.723。通过CytoHubba插件依据Degree算法筛选，图中颜色深浅和节点大小代表Degree值，节点越大、颜色越深Degree值越大，结果表明TNF、IL6、AKT1、IL1B、TP53等20个靶点Degree值较大，为核心靶点，核心靶点PPI网络见图3。

图3 归脾汤治疗ITP核心靶点PPI网络

2.6 GO功能与KEGG通路富集分析结果

利用DAVID6.8数据库进行GO功能与KEGG富集分析，设定P＜0.05为显著富集，富集结果显示，GO富集共507条，其中生物过程（BP）398条，主要为对药物的反应、凋亡过程的负调节、炎症反应、RNA聚合酶Ⅱ对转录进行正调控、细胞对脂多糖的反应等；细胞组分（CC）44条，主要集中在细胞外间隙、胞外区、胞浆、细胞表面、质膜外侧；分子功能（MF）65条，主要为蛋白质结合、酶结合、相同的蛋白结合、蛋白质异源二聚活性、转录因子结合等，见图4。

KEGG通路109条，主要涉及癌症（Pathways in cancer）、乙型肝炎（Hepatitis B）、T细胞受体（T cell receptor）、TNF信号通路、恰加斯病（Chagas disease）、前列腺癌（Prostate cancer）、胰腺癌（Pancreatic cancer）、百日咳（Pertussis）、Toll样受体（Toll-like receptor）、弓形体病（Toxoplasmosis）、膀胱癌（Bladder cancer）、结核病（Tuberculosis）、NOD样受体（NOD-like receptor）、HIF-1信号通路、破骨细胞分化（Osteoclast differentiation）、丙型肝炎（Hepatitis C）、慢性骨髓性白血病（Chronic myeloid leukemia）、甲流（Influenza A）信号通路。KEGG富集结果前20条通路见图5。气泡越大提示基因数量越多，颜色越接近红色代表P值越小，说明富集结果越显著。核心靶点TNF、IL6、AKT1、IL1B、MMP9、CASP3、MAPK3、JUN、PTGS2均被富集在TNF信号通路上。

图5 归脾汤治疗ITP靶点KEGG富集分析

2.7 分子对接结果

选取Degree值钱5位核心活性成分（槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、刺芒柄花素、异鼠李素）与Degree值排名前5位的核心靶点（TNF、IL6、IL1B、IL10、IFNG）按照“1.7”项中方法进行分子对接。若配体与受体结合能≤-5.0 kcal/mol说明结合活性较好，若配体与受体结合能≤-7.0 kcal/mol说明具有强烈的结合活性，结合能越低分子间结合越稳固[11]。结果显示，8组强烈结合活性，17组结合活性较好，见表1。运用PyMoL计算配体与受体RMSD，RMSD为受体与配体之间结构差异，用于评价分子对接是否成功，当RMSD＜2.0时认为对接结果较好，用于衡量结构稳定程度。选择5组最优构象利用PyMoL软件进行可视化，见图6。

表1 核心活性成分与核心靶点分子对接成果

图6 归脾汤有效成分与靶点蛋白分子对接模式

3 讨论

本研究基于网络药理学分析，发现归脾汤具有较多活性成分，其中槲皮素具有免疫调节、抗病毒、降糖、降脂作用[12]，山柰酚可诱导细胞凋亡、抗炎，豆甾醇可调节免疫、控制炎症，异鼠李素可抑制炎症反应、抗氧化及抑制血小板凝聚[13]，毛蕊异黄酮具有抗氧化及抗炎活性，原阿片碱可改善微血管循环、抗血小板凝集[14]，刺芒花柄素具有抗肿瘤、抗炎作用[15]。以上成分可能是归脾汤治疗ITP的关键成分。

PPI网络显示，PTGS2、HSP90AA1、PPARG等度值排名靠前，为归脾汤治疗ITP的主要靶点。相关研究表明，PPAR-γ可调控T细胞、巨噬细胞和与免疫调节相关细胞的活化、增生及炎症反应等，是炎症应激反应的重要靶点[16]；PTGS2可介导花生四烯酸代谢产生前列腺素E2，刺激产生基质金属蛋白酶，抑制T细胞凋亡，在炎症反应中发挥作用[17]。HSP90AA1具有免疫应答及减少炎症细胞因子分泌作用[18]。研究表明，归脾汤可能通过增加调节性T细胞数量和提高TGF-β1表达，进一步对T细胞、B细胞增殖活化起到抑制作用，最终使模型小鼠血小板计数升高[19]。本研究发现，归脾汤治疗ITP可能是通过槲皮素、山柰酚、异鼠李素、β-谷甾醇和刺芒柄花素等成分作用于PPARG、HSP90AA1、PTGS2等主要靶点发挥免疫、抗炎、提升血小板计数作用。

相关研究报道，气不摄血型ITP出血与TNF-α、IL-8（CXCL8）、IL-17A炎症因子高表达，IL-10抑炎相关因子低表达有关，促炎与抑炎表达失衡加剧血管损伤有关[20]，且ITP发病机制涉及Th1细胞分泌IFN-γ（IFNG）、IL-2和TNF-α促进细胞免疫，Th2细胞分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10等诱导体液免疫[21]。本研究结果显示，TNF、IL6、IL1B、IL8、IL10、IL4、PTGS2、IFNG、IL2等核心靶点在ITP发生中发挥重要作用，推测归脾汤可能通过调控TNF、IL8高表达和IL10低表达，以减轻血管损伤、减少出血症状；还通过调控IL6、IFNG、PTGS2、IL1B等核心靶点控制ITP，发挥抗炎、调节免疫作用。

GO富集结果显示，靶点主要参与炎症反应等生物过程，蛋白质结合、酶结合等分子功能。KEGG通路富集显示，主要富集在TNF、HIF-1、Toll样受体、NOD样受体、T细胞受体、破骨细胞分化信号通路，王艺超等[22]运用高通量基因芯片技术对ITP患者及正常人的脾巨噬细胞进行基因表达分析，其中差异表达基因信号通路涉及Toll样受体信号通路、T细胞受体信号通路，而且Toll、NOD样受体信号通路均涉及对炎症因子、免疫的调节。TNF作为一种关键的细胞因子，可诱导细胞凋亡、存活及免疫，故TNF信号通路也与炎症相关[23]。其中TNF信号通路除富集到9个核心靶点外，MAPK14、PIK3CG、NFKBIA、CXCL10、NFKB1、VCAM1、IKBKB、MAPK8等关键靶点也被富集于该通路，因此猜测TNF信号通路可能为主要作用通路。通过KEGG数据库整合结果发现，TNF、IL6、AKT1、CXCL8、IL4、IL10、IL1B、JUN、EGFR、MAPK3、IFNG、STAT3等核心靶点还作用于T细胞受体、HIF-1、Toll及NOD样受体信号通路。由此可见，这些通路是归脾汤治疗ITP的关键通路，涉及免疫、炎症、细胞凋亡、信号传导等。呼吸道病毒、人类免疫缺陷病毒、肝炎病毒、幽门螺杆菌、人类微小病毒B19、水痘-带状疱疹病毒感染等均可诱发免疫失耐受[24]，故推测KEGG富集的疾病通路与ITP发病诱因及病因可能存在一定联系，归脾汤通过这些通路控制ITP发病，发挥治疗作用。

本文运用网络药理学和分子对接技术，发现归脾汤治疗ITP具有“多成分、多靶点、多通路”的作用特点，归脾汤主要通过槲皮素、山柰酚、异鼠李素、刺芒柄花素、β-谷甾醇、粗毛甘草素F等活性成分，作用于IL6、TNF、IL1B、IL10、IFNG、CXCL8、MAPK3、IL4、IL2等核心靶点，通过TNF、HIF-1、Toll样受体、T细胞受体、NOD样受体等信号通路治疗ITP。本研究属理论探讨，仍需实验进一步验证。