基于网络药理学和分子对接探究健脾益肾方治疗糖尿病肾病的作用机制

刘哲延，祁爱蓉

1.广州中医药大学第四临床医学院，广东 深圳 518000；2.深圳市中医院，广东 深圳 518033

糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是临床常见的糖尿病并发症，主要表现为白蛋白尿排泄率持续增加和/或肾小球滤过率进行性下降，是引起终末期肾病的主要原因。目前临床治疗主要以肾素-血管紧张素-醛固酮系统抑制剂、利尿剂、控制血压、控制血糖及生活方式干预等为主，若进展至终末期肾病，则需通过血液透析，甚至肾移植来维持生命[1]。

研究表明，中医药治疗DN可有效降低患者尿蛋白水平，改善肾功能，延缓病情进展，提高患者的生活质量[2]。健脾益肾方是广东省名中医李顺民教授根据五脏相关理论归纳演绎出“脾肾相关理论”而创建的经验方，由白术15 g、大黄15 g、丹参30 g、豆蔻10 g、甘草10 g、黄芪30 g、肉苁蓉10 g、山药15 g组成，临床用于治疗DN疗效显著，可改善DN患者水肿、降低水钠潴留[3-5]。但其作用靶点及机制还有待进一步挖掘。

网络药理学综合医学、计算机学、生物信息学等多学科，是一种基于疾病、药物、化合物、基因靶点、蛋白相互作用的系统分析方法，可对中药治疗疾病的多成分、多靶点、多通路作用机制进行系统、深入、整体分析[6]。本研究采用中药复方网络药理学方法挖掘健脾益肾方活性成分、作用靶点及信号通路，探究其治疗DN的作用机制，为健脾益肾方的临床运用及进一步研究提供思路。

1 资料与方法

1.1 健脾益肾方活性成分筛选及相关靶点预测

检索TCMSP（https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）[7]中健脾益肾方组方药物白术、大黄、丹参、豆蔻、甘草、黄芪、肉苁蓉、山药的化学成分，以口服生物利用度（OB）≥30%、类药性（DL）≥0.18为条件[8]，筛选健脾益肾方组方药物活性成分。运用TCMSP预测活性成分的对应靶点，并以现有文献对未预测的药物活性成分和已验证的靶点进行补充。使用UniProt数据库（https://www.uniprot.org/）将所得靶点转换为相应的基因名称。

1.2 糖尿病肾病相关靶点筛选与收集

以“diabetic nephropathy”为检索词，检索GeneCards数据库（https://www.genecards.org）、OMIM数据库（http://omim.org）、DrugBank数据库（https://go.drugbank.com/）、TTD数据库（http://db.idrblab.net/ttd/）及DisGeNET数据库（https://www.disgenet.org），获得DN相关靶点。其中GeneCards数据库设定Score大于中位数的靶点为DN潜在靶点[9]。合并目标靶点并删除重复值，得到DN相关靶点，并利用UniProt数据库将所得靶点进行规范化处理。

1.3 药物-疾病交集靶点获取

利用Venny2.1.0在线工具（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html），将活性成分靶点与疾病靶点取交集，即为健脾益肾方治疗DN的潜在靶点。

1.4 蛋白质-蛋白质相互作用网络构建

将药物活性成分靶点与疾病靶点导入Cytoscape3.9.1软件，采用Bisogenet插件构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络，分别生成健脾益肾方活性成分靶点PPI网络与DN靶点PPI网络，并通过Merge功能提取2个PPI网络的交集网络，利用Network Analyzer[10]及CytoNCA[11]插件计算交集PPI网络的连接度（D）、介度（B）、紧密度（C）、网络中心性（NC）、局部边连通性（LAC）等网络拓扑学特征属性值。以度值＞2倍中位数，D、B、C、NC、LAC＞中位数的节点为核心靶点。

1.5 交集靶点GO功能和KEGG通路富集分析

将交集靶点数据导入Metascape数据库（http://metascape.org/gp/index.html），以P＜0.05且-log10Pvalue＞0.2为标准进行GO功能和KEGG通路富集分析，其中，GO功能富集分析包括生物过程（BP）、细胞组分（CC）、分子功能（MF）。采用微生信平台（http://www.bioinformatics.com.cn/），对BP、CC、MF富集基因数排名前10位的条目和富集基因数前20位的KEGG通路进行可视化展示。

1.6 “活性成分-靶点-信号通路”网络的构建

运用Cytoscape3.9.1构建健脾益肾方治疗DN“活性成分-靶点-信号通路”网络，并运用Network Analyzer及CytoNCA插件计算网络拓扑学特征属性值，筛选核心靶点和主要活性成分。

1.7 分子对接

分别取“1.4”网络及“1.6”网络中度值排名前5位的靶点作为受体蛋白（共10个），以及“1.6”网络中度值排名前5位的活性成分作为配体分子。从PubChem数据库（http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下载配体分子2D结构信息，再利用Chem3D软件将2D结构保存为“pdb”格式，并进行MM2能量最小化修饰。利用PDB数据库（http://www.rcsb.org/pdb）下载受体蛋白的3D晶体结构，并以PDB格式进行保存。利用PyMOL4.6.0软件对活性成分进行加氢（加电荷）、定义原子类型等处理后，保存为“pdbqt”格式；对核心靶点进行去水、加氢、定义原子类型，存为“pdbqt”格式。利用AutoDock Vina[12]进行分子对接。预测配体小分子与蛋白结合能，选择最低结合能为最优构象，利用PyMOL4.6.0软件将对接结果进行可视化展示。

2 结果

2.1 健脾益肾方活性成分及靶点获取

检索TCMSP，获得健脾益肾方组方药物活性成分188个，其中白术4个、大黄7个、丹参59个、豆蔻12个、甘草88个、黄芪16个、肉苁蓉3个、山药11个。同时查阅文献发现，白术内酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ为白术主要活性成分，具有抗炎性反应、抗肿瘤、调节免疫系统、降血糖、调节免疫代谢等作用[13]；黄芪中甜菜碱、黄芪多糖、黄芪甲苷具有抗炎、抗氧化、改善胰岛素抵抗、抗应激等多种活性作用[14-15]，对DN的治疗也起一定作用，故将以上成分补充纳入。汇总后共获得197个活性成分，其中10个成分为共有成分，见表1。获得健脾益肾方活性成分作用靶点分别为：白术64个、大黄64个、丹参134个、豆蔻185个、甘草226个、黄芪276个、肉苁蓉37个、山药68个，将靶点合并去重后，共获得363个靶点。

表1 健脾益肾方组方药物共有活性成分

2.2 糖尿病肾病相关靶点获取结果

检索GeneCards数据库、OMIM数据库、DrugBank数据库、TTD数据库、DisGeNET数据库分别获得DN相关靶点3 397、256、42、22、567个。其中GeneCards数据库将靶点Score值以中位数进行2次筛选，得到靶点828个。经合并去重后获得DN靶点1 347个。

2.3 获取成分-疾病共同靶点

利用Venny2.1在线工具将健脾益肾方药物活性成分靶点与DN相关靶点取交集，获得157个交集靶点。

2.4 蛋白质-蛋白质相互作用网络分析

利用Cytoscape3.9.1的BisoGenet插件分别构建健脾益肾方与DN的PPI网络，利用Merge功能提取两者交集网络，得到交集靶点PPI网络，共7 754个节点、186 599条边。计算交集靶点PPI网络拓扑学特征属性值，通过3次筛选，获得核心靶点53个，其中度值排名前5位的靶点分别为：TUBB、HNRNPK、NCL、PABPC1、DHX9，即为健脾益肾方治疗DN的核心靶点。筛选策略见图1，核心靶点PPI网络见图2。

图1 健脾益肾方治疗DN核心靶点筛选策略

图2 健脾益肾方治疗DN核心靶点PPI网络

2.5 生物信息学分析

利用Metascape数据库对157个交集靶点进行GO功能富集分析，得到BP条目2 094个、CC条目94个、MF条目167个。BP主要涉及对激素的反应、细胞迁移的正调控、对无机物的反应、对脂多糖的反应、对细胞外刺激的反应等；CC主要影响膜筏、囊泡腔、内质网腔、细胞外基质、质膜外侧面；MF包括蛋白激酶结合、RNA聚合酶Ⅱ特异性DNA结合转录因子结合、信号受体激活剂活性、heme血红素结合、脂质结合等多种蛋白、酶、脂结合。根据富集基因数筛选BP、CC和MF排名前10位的条目绘制条形图，见图3。

图3 健脾益肾方治疗DN靶点GO富集分析条形图

KEGG通路富集分析获得211条通路，主要涉及癌症通路、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、癌症中的蛋白聚糖、活性氧化物通路和HIF-1信号通路等。筛选富集基因数前20位通路绘制气泡图，见图4。

图4 健脾益肾方治疗DN靶点KEGG通路富集分析气泡图

2.6 “活性成分-靶点-信号通路”网络分析

运用Cytoscape3.9.1构建健脾益肾方治疗DN“活性成分-靶点-信号通路”网络，见图5。计算相关网络拓扑学特征属性值。结果显示，槲皮素、木犀草素、山柰酚、柚皮素、刺芒柄花素为健脾益肾方治疗DN的主要活性成分，见表2。预测AR、PTGS2、ESR1、PTGS1、PPARG是健脾益肾方治疗DN的核心靶点。

图5 健脾益肾方治疗DN“活性成分-靶点-信号通路”网络

表2 健脾益肾方主要活性成分

2.7 分子对接结果

将主要活性成分槲皮素、木犀草素、山柰酚、柚皮素、刺芒柄花素与核心靶点[TUBB（PDB ID：3S84）、HNRNPK（PDB ID：1J5K）、NCL（PDB ID：2FC8）、PABPC1（PDB ID：3KUJ）、DHX9（PDB ID：1UIL）、AR（PDB ID：1B0S）、PTGS2（PDB ID：1PXX）、ESR1（PDB ID：1A52）、PTGS1（PDB ID：1CQE）、PPARG（PDB ID：6FZY）]进行分子对接，对接结果见图6。

图6 健脾益肾方治疗DN主要活性成分与核心靶点分子对接热图

一般而言，配体与受体结合能与结合亲和力成反比。在AutoDock环境下，结合能＜-5 kcal/mol表明配体与受体结合活性较佳[16]。结果显示，在50组对接中，最低结合能＜-5 kcal/mol的有48组，提示靶点与活性成分间有较好的结合活性。分子对接构象图见图7。

图7 健脾益肾方治疗DN主要活性成分与核心靶点分子对接构象图

3 讨论

DN属中医学“下消”“肾消”等范畴，由于长期消渴，致使脏腑功能紊乱，阴阳气血虚衰所致。病变部位以肝、脾、肾三脏为主，痰、瘀、湿为病理因素。健脾益肾方由白术、黄芪、大黄、丹参、甘草、豆蔻、肉苁蓉、山药组成，有补脾益肾、化瘀祛浊之功。黄芪有补气升阳、利水消肿作用，可有效改善DN患者肾功能，减少尿液微量白蛋白水平[17]。大黄有泻下积食、逐瘀痛经、利湿退黄之功，其活性成分大黄素可降糖、改善微循环、抗炎、调节免疫及降低尿蛋白水平[18]。山药平补脾、肺、肾三脏，具有增加胰岛素分泌、提高胰岛β细胞机能、降低肾脏纤维化的作用[19]。丹参可活血调经、凉血消痈、清心除烦，其有效成分丹参素可降低DN大鼠血糖，改善肾脏纤维化，保护肾脏[20]。白术健脾益气、利水燥湿，可改善胰岛素抵抗，提高胰岛素敏感性，改善糖脂代谢[21]。豆蔻温中行气、化湿，可抑制肾组织细胞凋亡、氧化应激和炎症反应[22]。

3.1 药物活性成分分析

本研究得到健脾益肾方治疗DN的主要活性成分为槲皮素、木犀草素、山柰酚、柚皮素、刺芒柄花素，均为黄酮类化合物，具有抗炎、抗氧化等功能。槲皮素可降低糖尿病模型大鼠血糖浓度[23]，改善胰岛素抵抗[24]。一项横断面研究发现，中国人群中膳食槲皮素摄入量与2型糖尿病患病率呈显著负相关[25]，其可通过调节巨噬细胞极化改善肾损伤，缓解肾纤维化，保护肾功能[23]。木犀草素可激活AMPK/SIRT-1/PGC1-α蛋白表达，抑制高糖诱导的肾小球系膜细胞过度增生，促进其凋亡，对DN肾损伤具有保护作用[26-28]。山柰酚可激活AMPK通路，减轻高糖条件下肾小球内皮细胞氧化应激及凋亡，对肾功能有保护作用[29]。柚皮素可通过改善氧化应激、抑制细胞凋亡、减轻炎症反应等途径，保护肾功能，减缓DN进展[30]。芒柄花素可有效降低DN大鼠血糖和血脂，提高肾组织抗氧化能力，减轻DN氧化应激引起的肾损伤[31]。

3.2 关键靶点及信号通路分析

目前DN发病机制尚不明确，研究普遍认为与分子遗传学、代谢紊乱、血流动力学异常、炎症反应、内质网应激、氧化应激、自噬、外泌体等相关。根据靶点及通路特点，本研究发现，上述10个关键靶点及关键通路的作用机制包括抑制炎症、氧化应激，调节代谢紊乱，调控细胞凋亡及自噬，推测健脾益肾方通过上述3条途径发挥抗DN作用。

3.2.1 抑制炎症、氧化应激反应

PTGS1、PTGS2是编码相似酶的2个基因，可催化花生四烯酸转化为前列腺素，是前列腺素生物合成中的关键酶，与炎症反应相关。ESR1是雌激素受体的主要类型，可上调内皮型一氧化氮合酶mRNA水平，抑制炎症、氧化应激反应，从而改善肾脏损伤[32-33]。

HIF-1在机体抗缺氧防御系统中占据核心地位[34]，在DN的过程中起重要作用。同时DN状态下肾局部组织微循环障碍，导致体内活性氧（ROS）产生过多，生成大量氧化的中间产物，通过ROS一系列的信号传导途径，导致肾足细胞损伤。

3.2.2 调节代谢紊乱

晚期糖基化终产物（AGEs）是高糖状态下，蛋白质与葡萄糖等小分子发生非酶催化的糖基化反应形成的产物，糖基化终产物受体（RAGE）是一种跨膜受体，能与AGEs特异性结合。AGEs可直接作用于肾脏，其在肾脏的积累是进行性肾损害的主要原因[35]，也能通过AGEs-RAGEs信号通路及下游信号通路，如p38、NF-κB、TGF-β1、VEGF等表达，介导DN的发生[36-38]。

醛糖还原酶（AR）作为多元醇通路的限速酶，对通路的激活和DN的发展起重要作用。高糖状态下AR活性增加，使多元醇代谢通路产生的山梨醇增加，并大量蓄积，造成细胞内渗透压增高、细胞破裂，从而诱发细胞凋亡的发生，激活炎症反应，损伤肾小球细胞[39]。

3.2.3 调控细胞凋亡及自噬

近年研究发现，足细胞损伤是DN发生发展与转归的重要环节，其中足细胞的自噬缺陷起关键作用[40]。在肾小球过滤的最后一道屏障中，足细胞与足突之间的裂孔隔膜是主要组成部分，足细胞增殖和凋亡对维持肾小球滤过屏障的完整性至关重要[41]。糖尿病患者体内营养和能量过量会抑制自噬，并使足细胞出现功能障碍和细胞凋亡，导致大量蛋白尿的发生和肾小球纤维化[42]。

TUBB是人类基因组中存在的β-微管蛋白编码基因之一，参与细胞形态的维持及细胞有丝分裂等过程，与糖尿病发生发展相关[43]。TUBB还与脂代谢相关[44]，DN患者长期血糖偏高，代谢障碍，血流动力学改变，往往伴随高脂血症，加重肾损伤。NCL在纤维化、自噬、细胞凋亡等方面发挥作用，并且NCL参与肝脏糖代谢稳态调控，改善胰岛素抵抗、促进肝脏糖原合成，改善高脂饮食诱导的糖代谢紊乱[45]。PABPC1是RNA结合蛋白，调控RNA与mRNA代谢，与细胞生长发育相关，通过mTOR和AKT/MAPK信号通路调控细胞凋亡与自噬[46]。DHX9能通过多种癌症途径，如mTOR信号通路、p53通路等，参与调控细胞生命活动。同时KEGG富集分析显示，癌症途径是健脾益肾方治疗DN的关键通路之一。此外，癌症中蛋白聚糖通路也是重要通路。多项研究结果提示，糖尿病与多种肿瘤存在相关性，与本研究预测结果相符。高血糖环境下代谢障碍、ROS及AGEs产生增加，可能是导致糖尿病并发症和肿瘤的相关机制[47-48]。

此外，本研究对关键活性成分与靶点进行分子对接，结果显示，TUBB、HNRNPK、NCL、PABPC1、DHX9、AR、PTGS2、ESR1、PTGS1、PPARG关键靶点与槲皮素、木犀草素、山柰酚、柚皮素、刺芒柄花素分子对接较好。分子对接结果进一步表明，健脾益肾方可通过多成分、多靶点对DN起到治疗效果，并且通过分子对接验证了网络药理学预测结果的可靠性。

综上所述，健脾益肾方通过多成分、多靶点、多途径发挥治疗DN作用。本研究探究了健脾益肾方治疗DN的作用机制，为临床应用及进一步研究提供了思路。但本研究也存在一定局限性：①未考虑药物在体内代谢情况、药物煎煮后发生的化学反应及药物间的相互作用，因此无法全面获得复方实际的有效成分。②受限于现有网络药理学相关数据库，后续还需进一步更新及研究验证。