基于网络药理学预测石榴皮抗甲型流感机制及初步药效学验证*

邢亚东,杨 兵,丁 琪,罗凯文

(1.蚌埠医学院药学院,安徽 蚌埠 233000;2.河北大学药学院)

石榴皮(Punica granatum L.)是石榴科植物石榴成熟果实的果皮,具有止泻,止血等功效。其用药史最早可追溯于南北朝陶弘景的《本草经集注》:“味酸、甘,……,主治下痢、止漏精、蛔虫、寸白”[1]。该药在《中国药典》、《中药大辞典》等相关标准或书籍中均有收录[2-3]。近代药学研究发现石榴皮中含黄酮类、酚类、生物碱类、鞣质等药用成分,故具有抗氧化、抗炎、抗病毒与抗菌等药理作用[4-5]。

甲型流感在所有流感中流行范围最广、变异频繁、传染性最强,呈现季节性[6]。被甲型流感病毒感染的人或者动物出现鼻塞、咽喉肿痛等症状,严重者病毒可由呼吸道蔓延至下呼吸道致肺炎,更有甚者因肺部损伤致器官衰竭而引起死亡[7]。接种疫苗目前是临床预防甲型流感的最主要方式,常用的抗病毒药物有利巴韦林等,其不良反应及耐药性是该类药物的缺陷[8],而中药在抗病毒方面具有来源广、疗效明确、不良反应少等优点[9]。

张波等[10]通过对石榴皮的水提液进行体外实验观察其对流感病毒神经氨酸酶的活性影响,结果表明石榴皮水提液对流感病毒神经氨酸酶活性抑制率达到89.47%,但是其作用机制不详。随着计算机技术的发展,通过网络药理学及分子对接探寻中药有效成分治疗疾病的潜在靶点及通路已成为重要的技术手段。利用该技术可阐明石榴皮抗流感的可能作用机制和物质基础,所以本研究首次通过网络药理学与分子对接技术预测石榴皮中的潜在治疗成分及其作用靶点,并结合动物实验对其进行了验证,为进一步开发石榴皮及抗甲型流感奠定理论和实验基础,具有积极的药学及临床意义。

1 材料与方法

1.1石榴皮有效成分及相关靶点筛选 以“石榴皮”为关键词,其所含成分的检索在TCMSP平台(http://lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php,中药系统药理学数据库分析平台)中进行。过滤条件:口服生物利用度(OB)≥30%和生物活性(DL)≥0.18。两者数值的大小对筛出的成分评价其是否有药理活性具有一定的参考意义,同时在该平台中检索其有效成分所对应的作用靶点。

1.2甲型流感相关靶基因的获取 在Gene Cards、OMIM、DrugBank、PharmGkb、TTD数据库中以“influenza A”为关键词检索与甲型流感有关的靶基因,并将上述数据库所得的靶基因进行归纳整理。“1.1”项下的靶点所对应的基因利用Uniprot数据库(https://www.uniprot.org/)转换并归纳。将2次所得到的靶点信息进行基因映射取交集,得到活性成分-甲型流感共同作用的靶基因,并绘制韦恩图。

1.3活性成分-甲型流感靶点网络构建 将所得到的石榴皮候选化合物成分和甲型流感靶点进行归纳整理,所得数据导入Cytoscape(3.6.1版本)软件绘制石榴皮的活性成分-甲型流感靶点网络图。

1.4靶蛋白互作网络构建 STRING平台(https://string-db.org/)构建石榴皮抗甲型流感靶蛋白互作网络,进而明确石榴皮抗甲型流感靶蛋白之间的相互作用。将“1.2”项下检索出的抗甲型流感靶基因导入平台中,以“Homo sapiens”为物种,以“high confidence(0.900)”为最小阈值,隐藏游离节点,其余设为默认。

1.5GO及KEGG通路富集分析 对石榴皮抗甲型流感靶点进行GO(gene ontology)和KEGG(encyclopedia of genes and genomes)通路富集分析,该过程在DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov/)中进行。

1.6分子对接 对“1.1”和“1.2”项下所筛选的主成分和核心靶点利用AutoDock Vina软件进行分子对接。首先在Pubchem平台(https://Pubchem.ncbi.nim.nih.gov/)中下载主要化合物的3D结构,然后从PDB平台(http://www.rcsb.org/)下载靶点蛋白的PDB文件,通过AutoDock Tools对上述化合物和蛋白受体进行对接并得到二者的结合能。文献检索表明[11],结合能≤0或≤-5 kJ/mol分别表示配体与受体可结合或二者结合性能较好,结合能越小对接效果越好。

1.7动物实验

1.7.1病毒株 甲型流感病毒适应株PR8,购于中国预防医学科学院病毒学研究所,-80 ℃下保存备用。

1.7.2主要药品与试剂 异氟烷(批号20211009,深圳市永祥医药有限公司);肿瘤坏死因子-α(TNF-α,批号ELS-1901-2)、白细胞介素-1β(IL-1β,批号ELS-2214-2)、白细胞介素-6(IL-6,批号ELS-1693-2)试剂盒(博美生物有限公司);一抗:兔单克隆抗体TRAF6(货号ab33915)、p65(货号:ab32536);二抗:羊抗兔IgG(货号:ab6728)(Abcam公司);DAB显色试剂盒(上海经科化学科技有限公司);多功能酶标仪(型号:BS-1101,华泰和合商贸有限公司);电泳、转膜设备(型号:ZY5,青岛海德诚生物工程有限公司)。

1.7.3石榴皮药液的制备 石榴皮药材购于亳州中药药材市场,经亳州市食品药品检验中心汪海斌副主任中药师鉴定确为石榴科植物石榴的干燥果皮,打粉,称取石榴皮粗粉10 g于圆底烧瓶中,150 mL水浸泡20 min,加热回流,沸腾30 min,取滤液,药渣加水100 mL,沸腾15 min,合并煎液,5 000 r/min离心5 min,浓缩药液至50 mL,得0.2 g/mL的药液,备用。

1.7.4动物建模 SPF级ICR雄性小鼠共24只,体重为18.0～22.0 g,适应性饲养7 d,随机分成3组(石榴皮组、空白组、模型组),动物许可证号SCXK(皖)2022-001,建模:异氟烷麻醉小鼠,空白组给生理盐水,其余两组经鼻滴病毒稀释液,参考孙建辉等[12]建模方法,复制甲型流感的肺部感染模型(麻醉,PR8病毒滴鼻感染),感染当天石榴皮组给石榴皮药液,1 次/d,2.7 g/kg/次,5 d,剩余组给与等量生理盐水。

1.8检测指标

1.8.1小鼠生命体征观察 分别于实验前后记录小鼠体重,于给药后第6天,小鼠脱臼处死,肺脏称重,计算体质量及肺指数[肺指数(mg/g)=湿肺质量(mg)/体重(g)]。

1.8.2ELISA测肺组织中炎性因子水平 于给药后第6天脱臼处死,取左肺生理盐水洗涤,滤纸吸取水分,称重。肺组织低温匀浆后,4 000 r/min离心15 min,取上清液备用[13],按说明书检测鼠肺组织中TNF-α、IL-1β、IL-6的表达水平。

1.8.3Western blot检测肺组织中TRAF6、NF-κB蛋白表达 取小鼠右肺下叶适量,称重,剪碎,匀浆,加裂解液,于冰上裂解30 min,12 000 r/min离心10 min,取上清,通过蛋白质定量试剂盒法测定蛋白浓度,上样缓冲液调整浓度,100 ℃沸腾5 min。凝胶电泳分离蛋白,凝胶转移至PVDF膜上,室温下牛奶封闭,PBST洗膜,膜分别置于TRAF6、NF-κB p65、GAPDH一抗溶液中孵育(1∶4 000),4 ℃过夜,洗膜后,置于二抗溶液中(1∶4 000),室温孵育2 h,洗膜,ECL显影,凝胶成像仪中成像,内参蛋白为GAPDH,采用Image J软件对TRAF6、NF-κB p65、GAPDH条带灰度值进行分析。

1.9统计分析 采用SPSS 26.0统计软件分析小鼠的体质量、肺指数、炎症因子、蛋白表达水平等数据,结果以(均数±标准差)形式表示,采用单因素方差分析进行多组比较,SNK法用于两两比较,以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1石榴皮抗甲型流感活性成分筛选 以设置的条件检索后共得到6个化学成分,480个靶蛋白,6个潜在有效成分见表1。

表1 石榴皮潜在有效成分

2.2石榴皮抗甲型流感靶点筛选 将TCMCP中得到的靶基因去除重复的,得到177个对应基因,另通过其他数据库整理共得到与甲型流感相关基因2 239个。将石榴皮作用靶基因与甲型流感靶基因相互映射取交集共得到96个基因,见图1。

图1 石榴皮抗甲型流感靶点基因

2.3石榴皮活性成分-甲型流感靶点网络构建 活性成分-甲型流感靶点网络图中包含112个节点及171条边,其中6个红色节点表示石榴皮的活性成分,96个蓝色节点表示甲型流感靶点,171条边表示石榴皮中活性成分与甲型流感靶点间的相互作用情况。见图2。

图2 石榴皮活性成分-抗甲型流感靶点图

2.4靶点蛋白相互作用网络分析 将“2.2”项下石榴皮作用于甲型流感共有的96个靶蛋白进行互作分析,得到83个节点(其余13个未参与蛋白互作)和286条互作边,按相邻节点数目判断,RELA、MAPK1、JUN、HIF1A、ESR1、NFKBIA、TP53等靶点处于核心位置。见图3。

图3 石榴皮-甲型流感靶标蛋白相互作用网络

2.5关键靶标GO、KEEG富集分析 将蛋白互作网络中的96个蛋白靶点进行GO分类、富集分析,以P<0.05设定的条件进行筛选,依次列出前10名的路径(图4)。由图可知,生物过程(biological process,BP)中,石榴皮在对抗氧化反应、脂多糖、细胞对化学压力的反应等方面影响较大;细胞成分(cellular component,CC)层面上,石榴皮对膜筏、膜微区、分泌颗粒内腔、细胞器外膜等影响较大;分子功能(molecular function,MF)生物学上,石榴皮对调节细胞因子受体结合、细胞因子活性、因子结合泛素样蛋白连接酶结合反应等影响较大。

图4 GO分析气泡图

将蛋白互作网络中的靶点进行KEGG通路富集分析,同样以P<0.05为条件筛选,得到与甲型流感相关信号通路(图5),涉及Th-17细胞分化、PI3K-Akt信号通路、人巨细胞病毒感染、IL-17信号通路、肿瘤坏死因子信号通路等途径。

图5 KEGG富集分析气泡图

2.6分子对接结果 使用AutoDock Vina软件分别将活性成分与关键靶点进行对接(表2),根据表2的结果绘制结合能热图(图6)。该图的颜色深浅反应结合能绝对值的大小,颜色越深表示两者之间越易发生结合。从表中可看出,活性成分中鞣花酸、木樨草素、槲皮素、β山柰酚与对应的靶标结合能力较大,可知上述成分可能是石榴皮发挥抗甲型流感的活性成分。核心受体中的TP53与已筛选出的活性成分结合能数值的绝对值较小,NFKBIA与活性成分结合能数值的绝对值较大,表明NFKBIA靶标可能是潜在活性成分发挥药效的首选靶标。分子对接图见图7。

图6 活性成分与靶基因结合能热图

图7 分子对接图

表2 石榴皮潜在成分与受体对接结果

2.7各组小鼠的体质量、肺指数比较 与空白组相比,模型组小鼠感染5 d后的肺指数升高、体质量下降;与模型组小鼠相比,石榴皮组小鼠上述指标得到改善,组间差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 各组小鼠感染PR8病毒后的体质量、肺指数比较

2.8各组小鼠肺组织中3种炎症因子水平比较 与空白组相比,模型组肺组织中炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平均升高(P<0.05);与模型组小鼠相比,石榴皮组小鼠肺组织炎症因子水平均有所下调(P<0.05)。见表4。

表4 各组小鼠感染PR8病毒后肺组织3种炎症因子水平比较

2.9石榴皮对小鼠肺组织IL-17通路中TRAF6、NF-κB p65蛋白表达的影响 与空白组相比,TRAF6、NF-κB p65蛋白在模型组小鼠肺组织中表达均有增加(P<0.05);与模型组相比,石榴皮组中的TRAF6、NF-κB p65表达均有减少(P<0.05)。见图8。

图8 各组小鼠NF-κB p65、TRAF6蛋白表达水平

3 讨论

流感即为流感病毒引起的一种急性呼吸道感染性疾病,根据病毒基因的分类可分为甲、乙、丙三种类型,其中甲型较为常见,对人类以及哺乳动物产生了较为严重的健康威胁,因此该病在世界范围内引起高度的关注。中药在抗流感方面历史悠久,从《伤寒论》到近年来的新型冠状病毒肺炎的临床实践,都充分显示了中医药在抗流感方面具有独特的优势和不可或缺的地位。中药治疗疾病具有多成分、多靶点、多途径、药理作用机制复杂的特点。现有文献已表明石榴皮确有抗流感病毒的作用,但其作用机制与物质基础不详[10]。本文利用网络药理学中的“药物-成分-共同靶点-疾病”之间节点的复杂链接,从整体角度揭示石榴皮抗甲型流感病毒的机制及物质基础。

本研究对从石榴皮筛选得到的β-谷甾醇、儿茶素、鞣花酸、山柰酚、木樨草素、槲皮素、鄂贝新醇等活性成分进行分析。β-谷甾醇属于四环三萜类化合物,被誉为“生命钥匙”,其可通过增加SOD和GSH-Px两种酶的生物活性,降低过氧化氢酶活性;减少体内IL-6、IL-1、TNF-α等致炎因子的分泌[14]。亦可使人脐内皮细胞中的NF-κB p65表达下调,降低胞内ROS和NO的生成量及氧化应激,从而提升高糖环境中内皮细胞活性,对其损伤性减弱[15]。儿茶素、鞣花酸为多酚类化合物。儿茶素可通过抗氧化及下调iNOS表达,对大鼠肠黏膜屏障功能起保护作用,其对诺瓦克病毒感染小鼠肠炎细胞可使PKR磷酸化的表达量降低,TNF-α等炎性指标的分泌下降,进而使病变肠细胞的炎性反应降低[16-17]。鞣花酸通过抑制激活蛋白1和转录核因子的活性,抑制细胞因子IL-4、IL-5、IL-13的表达,细胞浸润现象得到抑制[18]。山柰酚、木樨草素、槲皮素为黄酮类物质。山奈酚作用于脂多糖诱导J774细胞和RAW264.7细胞,可抑制NO的产生,使炎症反应降低[19]。其保护脑组织的机制可能与增加脑动脉血流,脑供血不足得到改善,脑死亡面积减小,同时减少脑内具有细胞毒性的MDA和3-硝基酪氨酸的含量有关[20]。木樨草素可降低急性痛风性关节炎小鼠血清中IL-1β、IL-17、IL-6和TNF-α的表达水平,小鼠的踝关节肿胀度能被缓解,血清中的NF-κB蛋白表达相对降低[21]。在H1N1病毒感染的A549细胞中,木樨草素对其有一定的保护作用,机制分别与caspase-8介导的外源途径有关,进而使被病毒感染后的细胞凋亡数量减少[22]。槲皮素可降低因脂多糖诱导的小鼠巨噬细胞瘤细胞炎症因子IL-1、IL-6、IL-10的表达量,抗炎效果得到体现[23]。RAW264.7细胞的炎症模型由脂多糖诱导建立,在给与1.95 μg/mL的槲皮素后,细胞活力得到提升,活性氧量下降,COX-2活性被抑制,本次结果提示槲皮素在抗炎调控方面具有一定的应用价值[24]。以上研究表明,石榴皮中所含的有效成分可使炎症因子及相关活性蛋白的表达量减少,以此发挥其抗炎、抗氧化、抗病毒的作用。

RelA是核因子κB家族中主要亚单位,其可通过N末端DNA结合域形成二聚体从而对细胞增殖、分化及凋亡等相关基因表达起到调控作用,在哺乳动物体内涉及炎症、免疫反应等生理和病理活动。MAPK1也称为ERK或ERK2基因,该基因为MAPK信号通路中的关键激酶,在蛋白质编码与细胞的增殖等多种生物进程中不可或缺[25]。JUN属于激活蛋白,负责启动基因的转录,参与细胞增殖、凋亡和炎症反应,调节细胞存活、死亡等过程[26]。缺氧诱导因子1亚基α(HIF1A)是缺氧、血管生成、细胞增殖、代谢进展和转移的主要调节剂,参与多种免疫细胞表达过程,从而调节固有免疫和适应性免疫的微环境[27]。雌激素受体α基因(estrogen receptor 1,ESR1),属于蛋白质,存在于靶细胞内,参与细胞炎症、凋亡等途径。NFKB1可编码NF-κB家族中的亚单位p105与p50,抑制炎症因子如TNF-α等的转录,使抗炎细胞因子IL-1的转录得到促进[28]。

由KEGG富集分析可知:通路主要集中在PI3K-Akt、IL-17、人巨细胞病毒感染等通路。通过分析发现IL-17信号通路包含NF-κB、肿瘤坏死因子、Th17细胞分化三条通路,在通路富集总数目上最多,故本次选择IL-17通路并开展实验验证。IL-17是促炎细胞因子,当辅助性T细胞(Th17)被活化后可产生白介素,先天性免疫细胞也可分泌。IL-17家族共有IL-17(A-F)6个亚型,它们与IL-17受体结合后产生的信号可通过IL-17R/Act1/TRAF6信号轴激活下游的NF-κB等因子进而产生炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6等,炎症因子的释放,造成更严重的炎症反应。动物实验结果显示,炎症因子IL-6、TNF-α、IL-1β及TRAF6、NF-κB蛋白表达模型组高于对照组,石榴皮组低于模型组。不仅如此,体质量模型组小于对照组和石榴皮组,肺指数显示模型组大于空白组,石榴皮组小于模型组。结果提示石榴皮通过下调IL-17信号通路,抑制甲型流感病情的发展。说明石榴皮是通过多靶点、多通路来发挥抗甲型流感作用的,同时也证实了网络药理学的科学性。

综上所述,本研究采用网络药理学、分子对接并结合动物实验验证的方法,对石榴皮抗甲型流感进行了相应的分析与验证,推测石榴皮中的活性成分可通过多项生物学过程和信号通路,抑制了甲型流感的进程,体现了中医药治疗甲型流感的整体观的特点;此外,动物实验提示石榴皮能抑制甲型流感促炎因子产生,调控TRAF6、NF-κB p65的表达。本研究为后期进一步探索石榴皮抗流感及其药用价值开发提供一定的依据。