miR-431-5p通过MAPK/ERK通路促进食管鳞癌细胞增殖和迁移

金 戋，陈耀武，李阳坤，叶赛卿，钱昕晔，朱皓宇，徐雯轩，包晓红

（台州学院医学院，浙江 台州 318000）

0 引言

食管癌（Esophageal cancer）为常见的最具侵袭性的消化道恶性肿瘤之一，它有两种组织学亚型，即食管鳞癌（Esophageal Squamous Cell Carcinoma，ESCC）和食管腺癌（Esophageal Adenocarcinoma，EAC）。在全球癌症统计报告中，食管癌发生率排第六位，死亡率排第七位，且其5 年生存率低于20%［1-2］。中国的食管癌病例占全球的50%以上［3］。目前食管癌的主要临床治疗手段为手术切除、放化疗，但常规治疗的疗效有限且发生严重的不良反应［4］。西妥昔单抗（靶向表皮生长因子受体，EGFR）和贝伐珠单抗（靶向血管内皮细胞生长因子，VEGF）为代表的靶向治疗已被证实在食管癌的治疗中发挥着重要作用［4］。然而，食管癌的异质性，迫使研究者们寻求更多的潜在治疗靶点。ESCC 因缺乏其有效靶点，靶向治疗效果欠佳；微小RNA（microRNA，miRNA）是一种非编码小RNA，它参与包括食管癌在内的多种癌症的各个阶段［5］，在肿瘤发生发展中的作用显著，有望成为肿瘤治疗的有效靶点。已有研究报道，miR-431-5p 的异常表达在肿瘤发生发展过程中发挥了重要作用［6］，但其在食管癌中的作用尚不明确。本文通过检测miR-431-5p在食管癌中的异常表达，证实了miR-431-5p 参与ESCC 的细胞增殖、侵袭和迁移过程，并探索了其作用机制，为食管鳞癌的分子靶向治疗提供新的方向。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

人食管鳞癌细胞（ESCC）株TE-1 和TE-11 购自江阴齐氏生物科技有限公司；KYSE30、KYSE70 和KYSE450 购自南京科佰生物科技有限公司；ESCC 组织cDNA 芯片（癌/癌旁各15），上海芯超生物科技有限公司；miR-431-5p 模拟物和抑制剂，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；RPMI1640 培养基，美国Hyclone 公司；标准胎牛血清，美国Gemini Bio；CCK-8 试剂，美国APExBio 公司；BCA 定量试剂盒，美国Thermo Scientific 公司；兔抗人p-ERK（1/2）单克隆抗体（#4370）和兔抗人ERK 抗体（#9102），美国Cell Signaling Technology 公司；小鼠抗人β-actin 单克隆抗体（sc-69879），美国Santa Cruz 公司；HRP 标记山羊抗兔IgG（ab6789）多克隆抗体、HRP 标记山羊抗小鼠IgG（ab6721）多克隆抗体，英国abcam 公司；ECL发光液，上海碧云天生物技公司；transwell 板、Matrigel 基质胶，美国康宁公司；Thermo CO2细胞培养箱，美国Thermo 公司；BioTek Synergy H1 酶标仪，美国BioTek 公司；GE Amersham Imager 600 超灵敏多功能成像仪，美国GE 公司。

1.2 实验方法

1.2.1 TCGA（The Cancer Genome Atlas）数据库分析miR-431-5p 表达

从TCGA 数据库（https://portal.gdc.cancer.gov）下载并整理TCGA-ESCA（食管癌）项目BCGSC 流程的miRNA-seq 数据并提取RPM 格式的数据。利用R（4.2.1）软件分析miR-431-5p 表达，采用ggplot2［3.3.6］包对数据进行可视化。

1.2.2 组织cDNA 芯片PCR 及细胞RT-qPCR

根据天根miRcute miRNA 荧光定量检测试剂盒的操作步骤进行操作。配置20 μL qPCR MasterMix体系：2×miRcute Plus miRNA Premix 10 μL，正向引物终浓度200 nmol/L，反向引物（10 μmol/L）0.4 μL，ddH2O 补水至20 μL。将cDNA 芯片置于冰上静置15 min，振荡30 s，以3 000 r/min 转速离心3 min，上机实验。PCR 程序为：一阶段95 ℃30 s；二阶段95 ℃5 s，60 ℃30 s，循环40 次；三阶段95 ℃5 s，60 ℃1 min。

细胞培养至对数生长期时trizol 法提取其总RNA，测定RNA 浓度及纯度，进行反转录。具体反应如下：配置反应液去除DNA（5×gDNA Wiper Mix 2 μL、Total RNA 500 ng、无酶水补足至10 μL，40 ℃反应2 min）；在RNase-free 离心管中按说明书配置反应液，反应体系：上一步反应液10 μL、5XPrimmeScript RT Master Mix 2 μL、step-loop primer 0.2 μL、无酶水补足至20 μL。反应条件：25 ℃，5 min；50 ℃，15 min；85 ℃，5 min。PCR 反应体系：cDNA 0.5 μL，mQ primer R 0.4 μL，2×SYBR PCR Master mix 5 μL，上、下游引物0.2 μL，无酶水3.9 μL。反应条件：一阶段95 ℃，5 min；二阶段95 ℃，10 s、60 ℃，30 s 循环40 次；三阶段95 ℃，15 s、60 ℃，1 min、95 ℃，15 s。利用2^-(ΔΔCt)法分析数据。

1.2.3 细胞培养

将KYSE30、KYSE70、KYSE450、TE-1、TE-11 细胞培养于含体积分数为10%胎牛血清和青-链霉素各100 units/mL 的RPMI1640 培养基，置于37 ℃、体积分数为5% CO2的培养箱中；倒置显微镜观察细胞形态及生长情况，待细胞汇合度80%～90%时，胰酶消化，用于后续实验。

1.2.4 细胞转染

以每孔5×104个细胞接种到24 孔板中，过夜培养后进行细胞转染。50 μL Opti-MEM 稀释miR-431-5p模拟物和抑制剂（终浓度为50 nmol/L），混匀。再与50 μL Opti-MEM 稀释的LipofectamineTM 2000 混合，室温下静置20 min。将100 μL 转染复合物加入到未含血清的24 孔细胞板中，轻摇细胞板混合均匀，培养48 h。转染6 h 后换新鲜完全培养基。分组如下：①KYSE30+模拟物对照组（以下简称KYSE30-MNC）；②KYSE30+模拟物组（以下简称KYSE30-M）；③TE-11+抑制剂对照组（以下简称TE-11-I）； ④TE-11+抑制剂组（以下简称TE-11-I）。

1.2.5 CCK-8 细胞增殖实验

接种于6 孔板的细胞培养过夜后，转染miR-431-5p 模拟物和抑制剂24 h。经胰酶消化、离心重悬后，等体积接种于96 孔板。采用CCK-8 法检测转染24 h，48 h，72 h 时的细胞增殖情况。方法简述如下：10 μL CCK-8 加入每孔中，培养板置于37 ℃培养箱孵育2 h，用酶标仪测其吸光度值（A450nm），分析其数据。

1.2.6 细胞划痕实验

5×105个细胞接种于6 孔板，培养过夜。转染miR-431-5p 模拟物和抑制剂24 h 后，用移液器吸头划痕，以PBS 清洗细胞3 次，加入无血清培养基，0 h、48 h 时分别在显微镜下拍照纪录。用Image J 计算划痕面积。迁移率（%）=［（0 h 划痕面积-48 h 划痕面积）/0 h 划痕面积］×100%。

1.2.7 Transwell 实验

将4 ℃融化的转染基质胶用OPTI-MEM 培养基稀释（1∶20），加入Transwell 小室内，37 ℃固化1～2 h；再将0.2 mL、含5×104个转染48 h 的细胞的OPTI-MEM 培养液加入到Transwell 上室。Transwell 下室中加入0.6 mL 含有体积分数为20% FBS的OPTI-MEM 培养基。将Transwell 小室细胞置于37 ℃、体积分数为5% CO2的培养箱24 h，取出小室，固定、结晶紫染色、拍照。用Image J 计算细胞数量，计算细胞侵袭率。重复实验3 次。

1.2.8 Western blot 实验

3×105个细胞接种于6 孔板，培养过夜，转染miR-431-5p 模拟物和抑制剂48 h 后，提取其总蛋白，测其蛋白浓度。在质量浓度为4%～10%的不连续SDS-聚丙烯酰胺凝胶点样孔内加入等量蛋白样品，再电泳，转膜，封闭1 h 后，加入一抗（1∶1 000）稀释液4 ℃孵育过夜。TBST 清洗3 次，每次10 min。再加二抗（1∶10 000）室温孵育1 h，TBST 清洗3 次，每次10 min；最后用ECL 显色液进行显色、拍照。使用Image J软件分析条带灰度值。

1.2.9 数据处理

转录组公共数据库采用R（4.2.1）语言，ggplot2［3.3.6］包用于数据可视化，GraphPad Prism 8.0 软件用于实验数据的可视化。两组间比较采用t检验，P<0.05 为差异有统计学意义。

2 实验结果

2.1 miR-431-5p在食管癌中高表达

miR-431-5p 在食管癌中高表达情况如图1 所示。非配对样本（正常组∶食管癌组=13∶187）和配对样本（正常组∶食管癌组=13∶13）中，肿瘤组中miR-431-5p 的表达量均高于正常组（图1A 和图1B），且具有统计学意义（P＜0.01）。根据受试者工作特征曲线（ROC 曲线，图1C），ROC 曲线下与坐标轴围成的面积（AUC）值为0.870（CI：0.773～0.968），具有较好的诊断价值，说明miR-431-5p 的表达水平可能是ESCC 的潜在生物标志物。为了验证miR-431-5p 在ESCC 中的表达，我们在ESCC 组织和细胞中检测其表达情况。RT-qPCR 结果显示：与癌旁组织相比较，miR-431-5p 相对表达量高于1 的组织有5/15（30%，图1D），而在5 种ESCC 细胞系中表达量从高到低分别是TE-11、TE-1、KYSE450、KYSE70、KYSE30 细胞（图1E）。在后续的实验中，分别挑选表达量最低的KYSE30 和表达量最高的TE-11 细胞作为实验细胞。

图1 miR-431-5p 在食管癌中的高表达

2.2 miR-431-5p促进ESCC细胞增殖

采用RT-qPCR 方法验证转染miR-431-5p 模拟物后的KYSE30 细胞和转染抑制剂后的TE-11 细胞中miR-431-5p 的表达情况，结果如图2 所示。经miR-431-5p 模拟物转染，KYSE30 细胞miR-431-5p 相对表达量显著增加（图2A，P＜0.05），而经miR-431-5p 抑制剂转染，TE-11 细胞miR-431-5p 相对表达量显著降低（图2B，P＜0.001），说明miR-431-5p 模拟物和抑制剂有效。为了检测miR-431-5p 对ESCC细胞增殖的影响，KYSE30 和TE-11 细胞转染miR-431-5p 模拟物和抑制剂，检测其细胞增殖情况。转染72 h 时，与KYSE30-MNC 比较，KYSE30-M 组细胞吸光度值增加了24.19%（图2C）；与TE-11-INC 组比较，TE-11-I 组的细胞吸光度值降低了21.43%（图2D），表明miR-431-5p 促进ESCC 细胞增殖。

图2 miR-431-5p 促进ESCC 细胞增殖

2.3 miR-431-5p有利于ESCC细胞的迁移

miR-431-5p 模拟物和抑制剂分别转染于KYSE30 和TE-11 细胞后，细胞迁移率变化如图3 所示。KYSE30-MNC 组迁移率为15.93%，而KYSE30-M 组迁移率增加至46.79%（P＜0.001），TE-11-INC 组迁移率为27.37%，而TE-11-I 组迁移率降至17.85%（P＜0.05），这说明miR-431-5p 与ESCC 细胞迁移呈正相关，在其发展过程中可能发挥重要的作用。

图3 miR-431-5p 促进ESCC 细胞迁移

2.4 miR-431-5p有助于ESCC细胞的侵袭

Transwell 实验用于检测miR-431-5p 对ESCC 细胞侵袭的影响。KYSE30-MNC 组只有小部分侵袭过膜，而KYSE30-M 组侵袭过膜细胞明显增加（如图4 所示，P＜0.001），侵袭率增加了50.29%，这说明miR-431-5p 与ESCC 细胞侵袭呈正相关，在食管鳞癌发展过程中必不可少。

图4 miR-431-5p 促进ESCC 细胞侵袭

2.5 miR-431-5p通过MAPK/ERK通路促进ESCC细胞侵袭

为了探索miR-431-5p 对ESCC 细胞增殖、侵袭和迁移的作用机制，我们检测了p-ERK 蛋白表达（如图5 所示）。

图5 miR-431-5p 促进MAPK/ERK 信号通路

与KYSE30-MNC 组比较，KYSE30-M 组p-ERK 表达量增加11.68%（P<0.01）；而与TE-11-INC 组比较，TE-11-I 组p-ERK 表达量减少45.73%（P<0.01）。以上实验表明：miR-431-5p 通过上调MAPK/ERK 信号通路，促进了ESCC 细胞肿瘤的发生发展。

3 讨论

3.1 miR-431-5p可能是ESCC潜在诊断标志物

miRNA 大小约为22 个核苷酸，其表达失调在肿瘤发展过程当中发挥重要作用。随着miRNA 研究的深入，许多潜在的癌症生物标志物被提出可用于诊断和预后，这为癌症筛查提供了新的视角［7］。本文研究发现：miR-431-5p 在食管癌中高表达，具有较高的诊断价值，因此，它可作为潜在的诊断性生物标志物；并且miR-431-5p 对ESCC 细胞增殖、侵袭和迁移具有明显的促进作用。

食管癌组织RNA 公共数据库分析结果显示，食管癌中的miR-431-5p 表达显著高于癌旁组织。为了验证数据库分析结果的准确性，我们检测了ESCC 组织cDNA 芯片上miR-431-5p 表达，结果显示，1/3（5/15）组织高表达miR-431-5p。Xu 等［8］也通过RT-qPCR 的方法检测子宫颈腺癌中miR-431-5p 表达，其结果也显示了miR-431-5p 的高表达。然而，因样本数量较少，我们未能获得统计学上的显著差异。后续的研究拟扩大样本量，进一步表达其验证，以便更准确地分析miR-431-5p 表达量和评估其诊断价值。miR-431-5p 在ESCC 中的高表达是我们以miR-431-5p 作为靶点研究的重要依据。

3.2 miR-431-5p与ESCC发生发展密切相关

为了验证miR-431-5p 的功能，我们首先选择miR-431-5p 表达量最高的TE-11 细胞和表达量最低的KYSE30 细胞，再通过功能缺失和获得进行研究，发现miR-431-5p 能促进ESCC 细胞增殖、侵袭和迁移。miR-431-5p 在宫颈腺癌中的研究结果也显示miR-431-5p 促进宫颈鳞癌细胞生长。然而，miR-431-5p 在结直肠癌中的研究发现：miR-431-5p 的上调抑制了SW620 和HCT116 细胞的增殖和侵袭［9］；miR-431-5p在骨肉瘤组织中的过表达抑制了U2OS 和HOS 细胞的侵袭和迁移［10］；舌鳞状细胞癌组织中miR-431-5p受到竞争性内源RNA circ_0001742 的调控而表达下调，导致ATF3癌基因的高表达，在舌鳞状细胞癌中发挥抑癌作用［11］。

以上研究结果与我们的研究结果不一致，分析其原因，可能与miR-431-5p 的靶基因有关。根据ENCORI（The Encyclopedia of RNA Interactomes，http://starbase.sysu.edu.cn/tutorialAPI.php）数据库预测的miR-431-5p 的靶基因结果，LIMCH1（LIM and calponin-homology domains 1）可能为潜在作用靶点（数据未显示）。LIMCH1 蛋白是一种细胞骨架相关蛋白，属于LIM 蛋白家族。LIMCH1 为负调控因子，可能通过调控HUWE1 和p53 参与肺癌的发生发展［12］。另外一项基于免疫组化和生物信息学的研究发现，LIMCH1的表达缺失可预测肺鳞癌手术切除患者的不良预后［13］。miR-431-5p 在ESCC 中的表达上调，可能通过抑制LIMCH1 实现，从而促进ESCC 的增殖、侵袭和迁移。因此，须进行深入的研究加以验证。

上皮-间充质转化（epithelial to mesenchymal transition，EMT）是指非运动性上皮细胞向具有侵袭能力的间充质表型转变，是肿瘤转移的重要的生物学过程［14］。深入分析miR-431-5p 促进ESCC 转移EMT分子机制尤为重要。MAPK/ERK 信号通路调控肿瘤细胞的增殖和转移，包括食管鳞癌的EMT 过程［15-16］。ERK 是MAPK 信号通路中的关键调节因子，是将信号从表面受体传导至细胞核的关键［17］。ERK 参与调节细胞骨架组织、细胞运输、细胞黏附和代谢，而在癌细胞中，ERK 的磷酸化蛋白（p-ERK）的高表达常常与增殖、侵袭和耐药性有关［18］。因此，ESCC 细胞经miR-431-5p 模拟物/抑制剂转染后，检测其p-ERK 表达量。miR-431-5p 正向调节p-ERK 是我们的新发现。在食管鳞癌发生发展过程中，miR-431-5p 可能是一个重要的正向调节分子，通过调控MAPK/ERK 信号通路，使ESCC 细胞触发EMT 进程，从而参与ESCC 细胞的增殖、侵袭和迁移等过程。此外，miR-431-5p 还可能通过ROCK1/PI3K/AKT 通路调节肿瘤细胞增殖和转移［19］。上皮表面标志物（最显著的是E-钙黏蛋白）的缺失和间质标志物（包括波形蛋白和N-钙黏蛋白）的获得是EMT 发生的标志［14］。miR-431-5p 模拟物/抑制剂处理后，检测以上EMT 标志物，详细探究miR-431-5p 通过MAPK/ERK 通路促进EMT 的作用机制也是我们今后研究的方向。

4 结语

miR-431-5p 在ESCC 中表达上调，而且miR-431-5p 通过MAPK/ERK 信号通路正向调控ESCC 细胞的增殖、侵袭和迁移。深入探索miR-431-5p 的作用靶点以及分子机制，将为以miRNAs 为靶点的食管鳞癌诊断和治疗提供更有效的参考依据。