DNA 分子标记技术及其在犬品种鉴定中的应用

李 强 李 涛 魏荣兴 余传刚

随着社会科技和经济的发展，犬在人类社会中发挥着越来越大的作用。它们既可以作为人类忠实的伴侣辅助完成其日常的工作如陪伴、导盲、心理疾病治疗等，也可以作为警犬在巡逻、追踪、搜毒、搜爆等社会公共安全领域发挥着不可替代的作用。然而，由于传统上犬的品种是根据它们在人类活动中的作用、身体表型和历史记录进行分组的，所以不同品种的犬，性情和工作性能也不一样，尤其是在目前社会上涉犬案件的增多以及国家对于本土优秀犬种的种质资源保存与开发日益重视，因此开展犬品种鉴定工作迫在眉睫。

传统的犬品种鉴定方法是根据系谱或者体型外貌特征来判断，然而建立犬的系谱是一项漫长烦琐的工作，当前市场上许多养犬商家并没有意识和能力建立完善的系谱，导致品种鉴定不精准，系谱参考意义不大。此外，由于犬的品种众多，体型外貌特征复杂且有许多相似之处，想要依此来鉴定犬品种颇有难度。而DNA 分子标记技术近年来发展迅速，被广泛运用于各物种的品种鉴定的研究，相较于传统鉴定方法其特点在于可以在各个发育阶段、各个组织类别进行鉴定，不受环境与基因表达与否的影响，分子标记数量多，遗传稳定，具有较高的多态性，分布在有机体的整个基因组。同时不同犬品种之间的基因差异性和同一犬品种之间的基因同质性，以及犬基因种间差异大于种内差异，使得可以通过对犬品种的基因差异性和保守性的研究为犬的品种鉴定工作提供良好的条件，因此可以用DNA 分子标记技术来进行犬品种鉴定以获得更加准确的结果。

一、DNA 分子标记技术研究进展

DNA 分子标记是指以生物体内遗传物质DNA 的多态性为基础的遗传标记，是基因组特定区域的一段脱氧核糖核酸序列，这些序列根据孟德尔遗传定律，在群体中遗传生物体的基因特征。DNA 分子标记被用于识别种群内部和种群之间的基因变异，以及绘制许多物种的遗传图谱，在物种分类中占据主导地位，经过不断发展完善，已在各个生物体中大规模运用于遗传育种、疾病筛查、品种鉴定、法医鉴定等。根据DNA 检测方法的不同，主要分为三代：第一代以分子杂交为基础的分子标记技术，主要有限制性片段长度多态（RFLP）和数目可变串联重复多态性（VNTR）；第二代是以PCR 为基础的分子标记，主要包含随机扩增多态性（RAPD)、扩增片段长度多态性（AFLP)、简单重复序列（SSR)；第三代主要是以高通量测序和DNA 芯片技术为基础的分子标记技术，主要包含单核苷酸多态性(SNPs)和DNA 条形码技术(DNA barcode)，这些DNA 分子标记技术都各有优缺点和适用范围，目前最常用的分子标记主要是基于PCR 技术的SSR，以及基于DNA 测序的SNP。根据各个DNA 分子标记技术的特点及运用，以下主要介绍SSR 和SNP 在犬品种鉴定中的运用。

二、SSR 和SNP 在犬品种鉴定中运用

（一）SSR 在犬品种鉴定中运用

SSR 即微卫星DNA，又称短串联重复序列（STR），广泛分布于真核生物基因组内，突变率高，数量多，是一类由2～6个碱基组成的多次重复的序列，重复次数达10～60 次，使得片段长度变化极大，导致SSR 多态性极其丰富，而SSR 极高的多态性能够为犬品种鉴定提供更多的遗传多样性信息量，同时在传递过程中遵循孟德尔遗传规律，并呈共显性遗传，还具有灵敏度高、结果准确、操作简单等优点，所以被广泛应用到犬品种鉴定、遗传病筛查、繁殖育种、案件侦破等领域。

目前已有多人利用微卫星位点进行犬品种鉴定。Irion 等尝试利用分布在犬基因组中的100 个常染色体微卫星标记来检测美国养犬俱乐部(AKC)28 个品种内和品种间的基因型变异，根据由此产生的品种特异性等位基因频率来阐明系统发育和品种之间的遗传距离，进行品种鉴定。Koskinen 等研究探讨了基于10 个微卫星位点的聚类方法在鉴定5 个品种包括贝德林顿、德国牧羊犬、金毛寻回犬、威尔士柯基犬、腊肠犬共250 头家犬个体起源品种中的有效性，该研究表明，基于微卫星DNA 和现代聚类方法可以以非常高的准确率确定犬的品种。Parker 等通过对代表85 个品种的414 头纯种犬的96 个微卫星位点进行了基因分型，研究发现微卫星基因型可以被用来正确地分配99%的犬的品种，同时结合系统发育分析能将几个具有古代起源的品种与其他具有现代欧洲起源的品种区分开来。薛政通过利用已公布的65 个微卫星位点采用位点频率法、贝叶斯法和遗传距离法对39 个市场上常见宠物犬品种进行鉴定，贝叶斯方法的准确率最高，达到 97.91%，同时还计算出当检测位点从1个增加到25 个时，品种鉴定准确率迅速上升，之后增加检测位点，准确率基本稳定，随后采样本地12 个品种共15 头犬来进行验证，品种全部鉴定成功。韩宏晓等通过利用犬基因组数据库中的微卫星位点信息从中筛选出60 多个位点采用贝叶斯法、位点频率法和遗传距离法等方法对26 种常见宠物犬品种共128 头个体进行品种鉴定，发现筛选出的微卫星遗传位点可用于犬的品种鉴定，并通过后期从宠物医院选取的10 个品种合计50 头犬进行验证，结果显示所筛选得到的微卫星遗传标记位点可初步用于常见宠物犬种的鉴定。

（二）SNP 在犬品种鉴定中运用

SNP 主要是指基因组DNA 序列上单个碱基的变异所引起的DNA 序列多态性，包括单碱基转换、颠换、插入和缺失等多种形式，广泛分布于整个基因组，具有数量多，多态性高，突变率低，遗传稳定，易于实现高通量自动化检测的优点，尤其是随着下一代测序技术的不断优化，SNP 正变得越来越容易开发，成本也越来越低，因此SNP 作为分子标记已经有了应用于犬的品种鉴定中的基础。

Brouillette 等于2002 年在比格犬、杜宾犬和苏格兰约四十余头犬中对四种SNP 进行基因分型，并与哈代温伯格（Hardy-Weinberg）平衡下的预期基因型频率进行比较，结果表明SNP 位点可以在犬中用来作为品种鉴定的分子标记。Lindblad 等在2005 年通过鸟枪法测序，从11个犬种与参考序列的部分序列比较获得了250 万个SNP 数据，发现拳师犬的品种内SNP 差异性远小于与其他犬品种的差异性，表明了SNP 具有作为犬品种鉴定的分子标记的基础。刘毓文等在2017 年基于犬类22 万个DNA SNP 标记信息，开发了一种遗传算法，用以通过犬类 DNA SNP 数据来判断犬的品系组成，并通过实验验证，准确鉴定出来了犬的品种。罗晗等在通过筛选已公开的SNP 数据，开发一款专门为家犬品种分类制作的、低成本的、高效的SNP 芯片，只需要约1 万或者5 万个SNP 位点即可达成97%及最高可达99%以上正确率。

三、展望

犬一直不断地深入到人类的生活中，是人类生活中不可或缺的一分子，这就要求加强对犬的管理。通过DNA分子标记技术，我们可以从犬的分子水平对犬进行品种鉴定、繁殖育种、法医鉴定等，让犬更好地为人类服务。而SSR 和SNP 是目前最常用也是最有发展潜力的DNA 分子标记，其开发检测技术仍要朝着高效、便捷和低廉的方向发展，以期将来为犬的品种鉴定工作发挥更大的作用。