酒、醋、盐炙赤芍物性参数与化学成分相关性分析

王春燕，史可，王娇，马彦江，陈天朝，✉

（1. 河南中医药大学，河南 郑州 450008； 2. 河南中医药大学第一附属医院，河南 郑州 450000）

赤芍为毛茛科植物芍药（PaeonialactifloraPall.）或川赤芍（PaeoniaveitchiiLynch）的干燥根［1］。赤芍始载于《神农本草经》，其味苦，性微寒，归肝经，在临床上常以川芎-赤芍药对的形式出现，具有清热凉血、散瘀止痛之功效［2-3］。赤芍中化学成分复杂，不仅含有淀粉、糖类等大分子物质，亦有萜类及其苷、黄酮类、酚酸、鞣质类等小分子物质，其中萜类及其苷在芍药中的含量极高，是赤芍发挥药效的主要活性成分［4］。赤芍药理作用广泛，具有调节免疫、抗炎抑菌、抗肿瘤、抗抑郁等作用，可用于治疗抑郁症、癌症、糖尿病等临床常见病症［5］。赤芍生品微寒，经炮制后其寒凉之性可缓和，目前酒、醋、盐炙赤芍等炮制方法在临床最为常见［6-7］。

饮片在炮制过程中其内在化学成分和外在表观均会发生相应的变化，其质量亦会随之改变，而饮片炮制程度的判断常以炮制的经验为准，此标准极易受外界因素的影响而存在主观性较强、易出现个体偏差的缺点，进而无法通过炮制程度来把控赤芍饮片的炮制质量［8-9］。此外，目前对于把控中药饮片的质量多体现在检测其化学成分含量的研究上，评价指标极其单一，而中药饮片质量的优劣受化学成分和物理属性等多种属性共同影响［10-11］，因此本研究引入物性参数这一概念，通过测量赤芍及其炮制品的吸水膨胀度、氧化值、pH值及相对密度把饮片的外在表观“形、色、气、味、质”通过数字的形式更为直观地表达出来，并根据课题组前期在中药材料学研究的基础上选择赤芍中的主要大分子物质淀粉和有效成分芍药苷两类化学成分进行含量测定，运用CRITIC 客观评价法对赤芍炮制饮片中的化学成分（淀粉和芍药苷）进行权重评分，进而对含量和权重评分与物性指标（吸水膨胀度、氧化值、pH 值及相对密度）进行皮尔逊相关性分析，探讨酒、醋、盐炙赤芍物性参数与化学成分之间的相关性及不同炮制方法对赤芍饮片质量的影响，以期为赤芍及酒、醋、盐炙赤芍的质量评价提供一定的参考依据。

1 仪器与材料

1.1 主要仪器

炒药机（温州顶历医疗器械有限公司，型号：CY-25）；电子天平（北京医用激光仪器厂常熟分厂，型号：DT-400）；高速万能粉碎机（科伟永兴仪器有限公司，型号：FW-600）；紫外-可见分光光度计（赛默飞世尔科技，型号：Thermo Evolution201）；实验室pH 计（上海创益仪器仪表有限公司，型号：pHSJ-3F）；高效液相色谱仪（Waters中国有限公司，型号：e2695）。

1.2 主要材料

赤芍（安徽普仁中药饮片有限公司，批号：1712041）经河南中医药大学第一附属医院陈天朝主任药师鉴定，符合2020 年版《中华人民共和国药典》一部项下的各饮片来源规定；黄酒（浙江湖州市长兴县林城工业园区，执行标准：GB/T 13662）；米醋（山西紫林醋业股份有限公司，执行标准：GB/T 18187）；食盐（河南省卫裙多品种盐有限公司，批号：DZ-010）；支链淀粉（上海源叶生物科技有限公司，批号：J02M9M60109）；直链淀粉（上海源叶生物科技有限公司，批号：J17M9M56190）；纯度 ≥ 98%芍药苷（上海源叶生物科技有限公司，批号：X12ABC33672）。

2 方法与结果

2.1 物性参数测定

2.1.1 相对密度

准确称取赤芍及酒、醋、盐炙赤芍各5.0 g，分别投入盛有50 mL 轻质液状石蜡的100 mL 量筒中，静置待液状石蜡凹液面稳定时记录体积，结果见表1。

表1 赤芍及酒、醋、盐炙赤芍物性参数测定结果（n = 4）

2.1.2 吸水膨胀度

分别准确称取赤芍及酒、醋、盐炙赤芍各5.0 g，用量筒量取100 mL 蒸馏水，分别置于50 mL 锥形瓶中，于0、5、10、20、40、60、120、240、480、1 440 min 时过滤出饮片，锥形瓶中的液体倒进量筒中读取体积，记录数据。选择上述饮片吸水饱和时对应时间，浸泡中药饮片，记录排开水体积差值，根据膨胀度（S） = 膨胀后体积（V）/饮片重量（W）进行计算，平行测定3 份，取平均值，结果见表1。

2.1.3 氧化值

准确称取赤芍及酒、醋、盐炙赤芍各5.0 g，量取200 mL 蒸馏水于500 mL 圆底烧瓶中，摇匀后蒸馏，精确收集前50 mL 馏分。用移液管准确量取10 mL 馏分置于滴定瓶内，加入5 mL H2SO4水溶液和0.002 mol/L KMnO4溶液10 mL，振荡均匀，于室温下静置。加入0.15 g/mL KI溶液5 mL，滴加Na2S2O3标准溶液，当溶液由黄棕色变成浅黄色时，加淀粉指示剂1 mL，继续用0.101 2 mol/L Na2S2O3标准溶液滴定，观察颜色变至无色时，记录消耗Na2S2O3标准溶液体积为A（ mL）。取等体积水重复上述操作作为空白试验，记录消耗Na2S2O3标准溶液体积为B（ mL）。根据Ox =（B-A） ×C× 200（/5 × 0.002 ×V×M1）进行计算，结果见表1。

2.1.4 pH值

准确称取赤芍及酒、醋、盐炙赤芍各5.0 g于100 mL纯化水中，浸泡24 h，待溶液达到饱和时过滤，取滤液，用pH酸度计测定，记录相同温度下的各饮片pH值，结果见表1。

2.2 芍药苷含量测定

2.2.1 色谱条件选择

色谱柱：Agilent 色谱柱HC-C18（4.6 mm ×250 mm，5 μm）；流动相：甲醇-0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液（40∶60）；流速：1.0 mL/min；柱温：25 ℃，检测波长：230 nm，进样量：10 μL。芍药苷及赤芍不同饮片液相色谱图见图1、2。

图1 芍药苷对照品HPLC图

图2 赤芍及酒、醋、盐炙赤芍HPLC图

2.2.2 对照品溶液的制备

精密称取干燥至恒重的芍药苷对照品，加甲醇配制成1.65 mg/mL的对照品溶液，摇匀即得。

2.2.3 供试品溶液的制备

分别精密称取赤芍及酒、醋、盐炙赤芍约0.50 g，置于锥形瓶中，加入甲醇25 mL，称定重量，浸泡4 h，超声处理20 min，冷却至室温，称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，取滤液即得。

2.2.4 标准曲线的制备

分别精密吸取对照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL，甲醇定容至5 mL，稀释得系列浓度为0.16、0.33、0.66、0.99、1.32 mg/mL 的 对 照 品 溶 液，按“2.2.3”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，将峰面积Y 与进样浓度X 进行线性回归，得标准曲线方程为：Y= 12 461 386X-132 202，R² = 0.999 9，表明芍药苷在0.16～1.32 mg/mL范围内线性关系良好。

2.2.5 精密度考察

精密吸取芍药苷对照品溶液适量，于波长230 nm处连续进样6 次并测定芍药苷峰面积，计算得RSD=0.67%，结果表明该仪器的精密度良好。

2.2.6 重复性考察

精密称取赤芍同一份粉末6 份，样品溶液的制备按照“2.2.2”项下供试品溶液的制备方法操作，于波长230 nm处进样，计算得RSD = 1.44%，结果表明该方法的重复性良好。

2.2.7 稳定性考察

精密吸取供试品溶液适量，于制备后0、3、6、9、12、24 h 按照“2.2.1”项下色谱条件依次进样，并记录峰面积，计算得RSD = 0.39%，结果表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.2.8 加样回收率试验

取赤芍及其不同炮制品饮片粉末6 份，按“2.2.3”项下供试品溶液的制备方法操作，加入适量芍药苷对照品，按“2.2.1”项下色谱条件进样，记录峰面积，计算得加样回收率为99.76%，RSD = 1.33%，表明该方法的加样回收率良好。

2.2.9 含量测定

测得赤芍及酒、醋、盐炙赤芍的芍药苷含量依次为34.47、30.20、32.20、28.58 mg/g，结果见表2。

表2 赤芍及酒、醋、盐炙赤芍成分含量测定结果

2.3 支、直链淀粉含量测定

2.3.1 标准品溶液的配制

精密称量支链、直链淀粉标准品各0.100 g，用少量无水乙醇润湿，分别加入1 mol/L 的氢氧化钾溶液15 mL，水浴加热，蒸馏水定容至50 mL，得标准溶液。

2.3.2 吸收图谱的绘制

精密量取支链淀粉标准溶液7.0 mL、直链淀粉标准溶液2.0 mL于50 mL容量瓶中，加入25 mL蒸馏水，0.1 mol/L盐酸调节pH值为3.00，加0.2 mL碘试剂，蒸馏水定容，静置20 min。以加入0.1 mol/L 盐酸和碘试剂的蒸馏水为空白，在波长400～900 nm 范围内进行扫描，绘制可见光吸收扫描图谱。

2.3.3 测定波长及参比波长的确定

在紫外可见分光光度计400～900 nm 内进行扫描，确立两者的测定波长。运用等吸收点作图法得支链淀粉的测定参比波长分别为546、707 nm；直链淀粉的测定参比波长分别为610、481 nm。

2.3.4 标准曲线的绘制

精密吸取2 mg/mL支链淀粉标准溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mL，加25 mL左右蒸馏水，用盐酸调节pH值至3.00，加入0.2 mL碘试剂，于50 mL容量瓶中定容，混匀，得浓度40、80、120、160、200、240、280 μg/mL的标准溶液，在λ1、λ2两波长处分别测定A1和A2，即得ΔA=A2-A1，以ΔA 为纵坐标，支链淀粉浓度（μg/mL）为横坐标，绘制双波长支链淀粉标准曲线，回归方程为Y= 0.001 6X+ 0.000 8（R2= 0.998 3），结果表明支链淀粉含量在40～280 μg/mL 浓度范围内呈良好的线性关系。取2 mg/mL 直链淀粉标准溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL，加25 mL 蒸馏水，盐酸调节pH至3.00，加入0.2 mL 碘试剂，于50 mL 容量瓶中定容，混匀。得浓度20、40、60、80、100、120、140 μg/mL 的标准溶液。以加入盐酸和碘试剂的蒸馏水为空白，在λ3、λ4两波长处分别测定A3和A4，即得ΔA=A3-A4，以ΔA为纵坐标，直链淀粉浓度（μg/mL）为横坐标，绘制双波长直链淀粉标准曲线，Y= 0.002 6X+ 0.012 4（R2=0.997 9），表明直链淀粉含量在20.00～120.00 μg/mL浓度范围内呈良好的线性关系。

2.3.5 样品处理及样品溶液制备

分别精密称取赤芍及酒、醋、盐炙赤芍样品细粉适量，烘干5 h，置于干燥器内，冷却，测得水分含量为W（1%），将样品烘干后放入索氏提取器中，加入石油醚（30～60 ℃）浸没样品，加热回流4 h 进行脱脂处理，再加入85%乙醇，加热回流4 h 进行脱糖处理，放入干燥箱中烘干，干燥器内冷却后称重，测得糖分和脂肪含量为W（2%）。精确称取脱水脱糖样品0.100 0 g，无水乙醇将其湿润，加入浓度为1 mol/L 氢氧化钾溶液10 mL，沸水浴中分散溶解10 min，加蒸馏水定容至50 mL，混匀。吸取样品液3 mL，加入25 mL蒸馏水，用0.1 mol/L 盐酸调节pH 值至3.0，加0.4 mL 碘试剂，蒸馏水定容至50 mL，混匀后静置。

2.3.6 精密度考察

精密吸取支、直链淀粉对照品溶液适量，按照“2.3.4”项下处理方法处理，连续测定6 次，经计算得到支链淀粉和直链淀粉的RSD 值分别为1.21%、0.56%，结果表明该仪器的精密度良好。

2.3.7 重复性考察

精密称取赤芍样品6 份，按照“2.3.5”项下方法制备供试品溶液，测定支链、直链淀粉吸光度，经计算得到两者的RSD 值分别为1.22%、0.56%，结果表明该方法重复性良好。

2.3.8 稳定性考察

取“2.3.5”项下样品溶液，在“2.5”项下波长处，分别于0、10、20、30、40、50、60 min时间点在“2.3.3”项下波长处进行测定支链、直链淀粉吸光度，经计算得到两者的RSD 值分别为1.27%、3.23%，结果表明该样品溶液在60 min内稳定性良好。

2.3.9 含量测定

依据回归方程求出样品溶液中支链淀粉浓度Y支（μg/mL）和直链淀粉浓度Y直（μg/mL），测得赤芍及酒、醋、盐炙赤芍中支链淀粉的含量依次为15.59%、15.73%、14.16%、16.30%；直链淀粉的含量依次为9.55%、9.10%、6.76%、8.70%。结果见表2。

2.4 CRITIC法确定各指标成分权重

CRITIC 法（criteria importance through intercriteria correlation）是一种基于指标相关性的权重确定方法［12-13］，其中以变异性和冲突性为基础，分别通过标准差和相关系数的形式体现评价指标之间的变异性和冲突性，此评价方法较为客观。首先对生品及酒、醋、盐炙赤芍的芍药苷和淀粉含量进行标准化处理，然后运用SPSS25.0 软件对数据相关性分析，得相关系数矩阵表，结果见表3。

表3 各指标相关性

①按照公式（1）指标数据的无量纲化处理。

②按照公式（2）用处理后的数据计算对比强度。

③按照公式（3）用处理后的数据计算冲突性。

④按照公式（4）计算指标的客观权重。

公式（1）中对于第i个个体，第j个指标越高越好，而赤芍中芍药苷、支链淀粉、直链淀粉含量愈高愈好可应用此公式；公式（2）中Zij为无量纲处理后的样本指标值；公式（3）和（4）中Cj表示第j评价指标所包含的信息量，δi为标准化之后各列指标的标准差，Wj表示第j个指标的客观权重。最终计算赤芍各指标的变异性、冲突性、信息量及客观权重，其中客观权重系数分别为0.464 9、0.314 7、0.220 4，结果见表4。

表4 相关指标数据

根据公式Y=（Y1i/Y1max）权重100 +（Y2i/Y2max）权重100 +（Y3i/Y3max）权重100 对已得出的权重系数加权得权重评分，结果见表5。

表5 CRITIC权重评分表

2.5 物性参数与化学成分相关性分析

采用软件SPSS25.0 对赤芍不同炮制品的相对密度、吸水膨胀度、氧化值、pH 值和芍药苷、支链淀粉、直链淀粉进行Pearson 相关性分析，结果见表6。通过分析相关性可知，酒、醋、盐炙赤芍的物性参数与化学成分之间具有相关性，其中相对密度与芍药苷呈正相关，吸水膨胀度与芍药苷呈负相关（P＜ 0.05）。

2.6 回归模型的建立

2.6.1 芍药苷含量与物性参数回归分析

在芍药苷含量与相对密度、吸水膨胀度的多元线性回归分析中发现，自变量之间存在共线性，因此采用“步进法”，余下吸水膨胀度一项自变量，因此建立逐步回归分析模型为Y（芍药苷）= 154.386-52.239X（吸水膨胀度），R2= 0.968，P= 0.016 ＜ 0.05，该模型具有统计学意义，芍药苷含量与吸水膨胀度呈负相关，可用吸水膨胀度预测分析芍药苷含量，ANOVA表见表7。

表7 芍药苷含量与吸水膨胀度回归模型ANOVA表

2.6.2 权重评分与物性参数回归分析

在权重评分与物性参数的相关性分析中发现，只有氧化值与权重评分具有相关性，相关系数为0.996，因此建立回归方程为Y（权重评分）= 65.765 + 4.216X（氧化值），R2= 0.992，P= 0.004 ＜ 0.01，该模型具有统计学意义，权重评分与物性参数氧化值呈显著正相关，可用氧化值根据此模型在一定程度上预测分析赤芍炮制品的质量，ANOVA表见表8。

表8 权重评分与氧化值回归模型ANOVA表

3 讨论

3.1 炮制方法的选择

赤芍味苦微寒，生用以活血化瘀、清热凉血作用为主，多用于治疗各种吐血、衄血症［14］，其炮制后寒凉之性可缓和，常用有酒、醋、盐炙等炮制方法。酒可渗入到赤芍内部细胞中溶解生物碱并形成溶液，进而可以通过内部细胞间隙扩散到赤芍的各个部位发挥药效［15-16］。醋为弱酸，可与赤芍中的游离生物性碱结合生成可溶性盐，增加其在水中的溶解度，提高生物利用度［17-18］；并且中医五行学说认为“五味入五脏”，醋以酸味为主，酸又入肝，因此赤芍经醋炙后引药入肝经，增强疏肝理气、活血化瘀止痛的作用［19-22］。盐炙法即把加水溶化的食盐与中药饮片加热拌炒［23］，盐水对饮片细胞的穿透力较强，可增加药物成分的溶解度及煎出量，起到增强疗效、扩大临床药用范围的目的，调节了机体的水液代谢平衡，增加肾脏对水的通透性［24］。

3.2 评价指标的选择

中药化学成分复杂，经液体辅料炮制后药材内部分子结构发生变化，进而其化学成分、物理化学性质及总体质量也会发生改变，而物理化学性质是饮片性状鉴别中反映形、色、气、味、质的内在因素［25-26］。“形”即饮片的形状和大小；“色”代表化学结构、功能团/呈色团；“气”一般为挥发性，氧化值可替代；“味”可以测量饮片pH 值；“质”即饮片的质地，可用相对密度代表［27-28］。2020年版《中华人民共和国药典》中规定芍药苷作为检测赤芍质量的指标成分，但赤芍中化学成分众多［29］，在炮制过程中不能只凭借单一指标成分来评判饮片炮制质量，而是需要多种指标参数为指导，因此选用赤芍中的主成分淀粉和药理活性显著的芍药苷两个化学成分指标进行含量测定，以大小分子相结合的方式去研究分析［3，30］；物性参数中选取相对密度、吸水膨胀度、氧化值、pH 值4 个物性指标，通过测定上列指标数据，探究赤芍炮制品物性参数与化学成分之间的相关性，这对于评价酒醋盐炙赤芍饮片的质量具有一定可靠性。

3.3 权重方法的确定

在综合评价中对于各个指标权重系数的确定是科学准确做出评价的基础［31］，现如今主要有主、客观两类赋权方法确定权重系数，其中主观赋权法以AHP 层次分析法为代表，此评价方法往往是根据个人的主观经验对各指标之间的关系进行判定，片面性较强，因而其评价结果具有很强的主观性［32］；而CRITIC 法作为客观赋权法的代表之一，把真实数据作为基础，以变量和冲突为依据，以标准偏差的形式表示冲突，进而得出各指标的权重系数，相较于主观的赋权方法，CRITIC 赋权法更加科学合理、准确真实，更客观全面［33-34］。

中药饮片的炮制过程是动态变化的，其质量随炮制程度的不同而发生改变，目前对于中药炮制品的质量大多是从其“形、色、气、味、质”五个方面去直接判断其真伪优劣，此方法虽简单易行，但主观性较强。本课题组对于中药的“物性参数”的探究已有多年，因此本研究引入这一概念，测量酒、醋、盐炙赤芍的物性指标和化学成分，采用CRITIC 法对赤芍饮片中的淀粉和芍药苷两个化学指标进行权重分析，进而利用SPSS 软件进行相关性分析得回归方程，得出芍药苷含量与吸水膨胀度呈显著负相关；赤芍饮片的权重评分与氧化值有显著相关性，表明构建的回归模型具有统计学意义。已有研究表明芍药苷是赤芍发挥药效的主要活性成分［35］，此外《中华人民共和国药典》中把芍药苷作为检测赤芍质量的唯一指标成分，因此在一定程度上可用吸水膨胀度预测分析酒醋盐炙赤芍中芍药苷含量的高低，进而可作为赤芍炮制过程中质量控制的一个标准，以便于对其质量进行预测，为中药的质量评价标准提供一定的参考依据。但因本研究样本量准备不够充分，后期会加大样本量以保证该结果的准确性。