冻融移植周期囊胚自发性皱缩对妊娠结局和新生儿结局的影响*

李 丹, 余 琼, 刘 群, 任新玲, 靳 镭

华中科技大学同济医学院附属同济医院生殖医学中心,武汉 430030

自发性皱缩是囊胚在扩张过程中常见的一种现象,它指的是≥50%的滋养外胚层细胞表面从透明带的内侧自然分离[1],囊腔出现塌陷。自发性皱缩发生的原因尚未可知,其是否影响辅助生殖技术(assisted reproductive technology,ART)妊娠结局及新生儿结局的研究也较少。目前胚胎选择主要依据形态学评估,按照Gardner囊胚评分体系[2]根据囊胚腔扩张程度、内细胞团(inner cell mass,ICM)和滋养层细胞(trophectoderm,TE)的形态和数目对囊胚质量进行分级,该系统并没有涵盖囊胚形态的所有方面,有其局限性。本研究通过观察冻融移植周期囊胚自发性皱缩和妊娠结局之间的关系,探讨自发性皱缩是否是影响妊娠结局的预测因素,并可能为胚胎选择提供新的方法,以改善ART后的妊娠结局。

1 资料与方法

1.1 研究对象

回顾性分析2018年1月至2020年12月在我院接受单囊胚冻融移植的10120个周期的临床资料,将移植胚胎为自发性皱缩囊胚的133个周期(皱缩组)作为研究对象,为避免选择偏倚,倾向性评分匹配(propensity score matching,PSM)优先匹配女方年龄、促卵泡激素(follicle-stimulating hormone,FSH)、体质量指数(body mass index,BMI)、不孕类型、子宫内膜厚度后获得133个周期移植胚胎为未皱缩囊胚(未皱缩组),分别比较两组的妊娠结局和新生儿结局。纳入标准:①夫妻双方染色体核型正常;②单囊胚移植周期;③移植胚胎为自发性皱缩囊胚(图1)。排除标准:复苏后激光人工皱缩未完全扩张的胚胎。本研究通过本院医学伦理委员会批准,所有患者夫妻双方均了解并知情同意。

左图所示为皱缩组移植囊胚,右图箭头所示为自发性皱缩

1.2 研究方法

1.2.1 囊胚培养及评估 按本中心常规方案促排卵,当有2～3个优势卵泡直径≥18 mm时肌肉注射人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin,HCG)10000 U,36 h后在阴道超声监测下穿刺取卵。取出卵母细胞后,采用常规体外受精、卵胞浆内单精子显微注射技术(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)进行受精,受精后将胚胎置于G-1卵裂培养液(Vitrolife,瑞典)中,在37℃,6.0% CO2,5.0% O2,89.0% N2的EmbryoScopeTM延时监测(time-lapse monitoring,TLM)培养箱(Vitrolife,瑞典)中进行体外胚胎培养。16～18 h观察原核后继续培养至第3天,根据胚胎卵裂情况,挑选1～2个卵裂期胚胎用于新鲜周期移植或冷冻,剩下的胚胎转移至G-2(Vitrolife,瑞典)囊胚培养液中继续培养到第5天(D5)或第6天(D6),将达到冷冻标准的囊胚进行玻璃化冷冻保存,在玻璃化冷冻保存前对完全膨胀的囊胚进行激光人工皱缩。囊胚形态评估按照Gardner囊胚评分体系[2]根据囊胚腔扩张程度分为6期:1期,囊腔出现,囊腔范围小于胚胎体积的一半;2期,囊腔范围等于或大于胚胎体积的一半;3期,囊腔占满胚胎,但未完全扩张;4期,囊腔完全扩张,体积增大,透明带薄;5期,囊胚正从透明带(zona pellucida,ZP)孵出;6期,囊胚完全从ZP孵出。再根据ICM和TE的形态和数目对囊胚质量进行分级。ICM分级:细胞数目多,排列紧密为A级;细胞数目少,排列松散为B级;细胞数目很少为C级。TE分级:细胞数目多,结构致密为A级;细胞数目少,排列松散为B级;细胞数目很少为C级。

1.2.2 囊胚冷冻及复苏程序 本研究所用冷冻液、载杆、复苏液均购自日本KITAZATO生物制药有限公司。按照本中心常规步骤进行囊胚冷冻复苏[3]。复苏后的囊胚均置入37℃,6.0% CO2,5.0% O2的培养箱培养,2～4 h后观察囊胚色泽及囊胚腔是否重新扩张,进行移植,囊胚腔重新扩张且形态清晰、光泽明亮的囊胚被认为存活。

1.2.3 妊娠及新生儿结局的评估 囊胚移植后12～14 d进行HCG检测。着床指囊胚移植4～6周行阴道B超可见到孕囊;临床妊娠为囊胚移植后至少5周行阴道B超可见孕囊,包括宫外孕;临床妊娠后12周内无胎心活动为早期流产;活产周期中,满20周至37周前分娩为早产;出生缺陷是指在出生时或出生以后表现的结构、功能或发育异常。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 两组间基础资料的比较

经PSM匹配后得到皱缩组与未皱缩组各133个周期。PSM后两组的女方年龄、FSH、BMI、不孕类型、子宫内膜厚度等的差异均无统计学意义(均P>0.05)。见表1。

表1 倾向性评分匹配后两组间基础资料的比较[M(P25,P75)]

2.2 移植囊胚出现自发性皱缩现象

观察胚胎出现自发性皱缩现象,滋养外胚层细胞表面从透明带的内侧自然分离的面积≥50%,囊腔出现塌陷。见图1。

2.3 两组的妊娠结局比较

皱缩组活产率明显低于未皱缩组(30.08%vs.45.86%,P<0.01),皱缩组着床率、临床妊娠率降低,早期流产率升高,但与未皱缩组差异均无统计学意义(均P>0.05)。见表2。

表2 两组妊娠结局比较[n(%)]

2.4 多因素Logistic回归分析各因素对活产率的影响

对影响母体活产的相关因素进行Logistic回归分析结果显示,女方年龄、不孕类型、囊胚是否发生自发性皱缩对活产有显著影响(均P<0.05),考虑到其它协变量后,囊胚皱缩组与未皱缩组的活产优势比(odds ratio,OR)为0.54(95%CI:0.32～0.91)。见表3。

表3 多因素Logistic回归分析各因素对活产率的影响

2.5 两组新生儿一般情况及结局比较

皱缩组和未皱缩组各有1个双胎妊娠活产周期(2个均为男性双胎),本研究仅比较两组间单胎妊娠的新生儿结局。两组间新生儿出生时天数、出生体重、男性新生儿比例比较,差异均无统计学意义(均P>0.05)。见表4。两组活产新生儿中各有2例早产,皱缩组单胎妊娠新生儿有1例出生缺陷,为婴儿肾上腺增大;未皱缩组单胎妊娠新生儿无出生缺陷。

表4 两组单胎妊娠新生儿结局比较

3 讨论

近年来,随着社会压力增大、环境污染加剧以及妇女生育年龄推迟,不孕症患病率逐年上升[4-5],其中许多人最终需要ART进行治疗。ART已经从实验性程序发展成为一种主流医学,为世界带来了700多万儿童[6]。尽管技术不断改进,仍然有几乎一半的患者在接受几个周期治疗后都没有成功活产[7]。同时由于胚胎着床效率低,移植多个胚胎导致了较高的多胎妊娠率。所以,目前体外受精的主要目标之一就是如何选择最合适的胚胎移植以提高活产率,同时将多胎妊娠相关的并发症降到最低。本研究观察冻融移植周期囊胚自发性皱缩是否影响妊娠结局,期望可以改进胚胎选择的方法,以改善ART后的妊娠结局。

自发性皱缩是发生在囊胚孵化过程中常见的一种现象,其发生仅需几秒,可持续1～2 h且可以多次发生。自发性皱缩最早见于哺乳动物的胚胎,Lewis等[8]用延时摄影技术监测体外培养的兔子囊胚8 d,发现囊胚在发育过程中会出现反复收缩和再扩张。Massip等[9-10]在奶牛模型上发现,自发性皱缩影响奶牛囊胚的正常孵化,囊胚在扩张过程中被多次自发性皱缩反复打断后,即使ZP破裂囊胚也不能正常孵化,囊胚最终坍塌和退化。Niimura[11]通过延时显微摄影技术分析小鼠囊胚的收缩情况,出现连续的弱收缩(体积缩小<20%)的囊胚大部分能正常孵化,而那些出现强烈皱缩(体积缩小≥20%)的囊胚则不能正常孵化,囊胚是否出现强烈皱缩可以用来评估小鼠胚胎的发育能力。Iwata等[12]观察人类囊胚体外孵化的过程也报道了类似的结果,未孵化囊胚的自发性皱缩次数明显高于成功孵化的囊胚,囊胚经历几次自发性皱缩后最终退化。

Marcos等[1]将滋养外胚层细胞表面从透明带的内侧分离的面积≥50%定义为皱缩,面积<50%为胚胎搏动,视为收缩,并首次报道了人囊胚自发性皱缩对妊娠结局的影响。通过TLM精确观察到囊胚自发性皱缩与植入率降低相关(35.1%vs.48.5%,P<0.05),建议优先选择没有出现自发性皱缩的囊胚移植,并建议将囊胚是否出现自发性皱缩作为现有胚胎选择模型的附加标准。Sciorio等[13]通过TLM回顾性分析了356个新鲜周期D5单囊胚移植的妊娠结局,结果发现与294例移植未皱缩囊胚周期相比,移植62例自发性皱缩囊胚(体积减小≥50%)周期植入率(22.6%vs.61.2%,P<0.01)和持续妊娠率(ongoing pregnancy rate,OPR)明显降低(17.7%vs.53.7%,P<0.01),囊胚出现自发性皱缩可以作为低妊娠结局的胚胎标志物。Sciorio等[14]另一篇研究回顾性分析了1297例新鲜周期D5单囊胚移植的妊娠结局后发现,移植自发性皱缩囊胚周期(259例)持续妊娠率显著下降(37.5%vs.51.9%,P<0.01),对OPR进行Logistic回归分析后未皱缩组与皱缩组囊胚植入的OR为1.99(95%CI:1.43～2.75),移植自发性皱缩囊胚后植入并产生妊娠的可能性更小,自发性皱缩可以作为单囊胚移植胚胎选择的新标志物。

在本研究中,我们回顾性分析了冻融移植周期单囊胚移植后自发性皱缩与妊娠结局的关系,与未皱缩组相比,皱缩组的着床率、临床妊娠率、活产率均有一定程度降低,早期流产率升高,但仅活产率差异有统计学意义(P<0.01)。考虑混杂因素后,皱缩组与未皱缩组的活产OR为0.54(P<0.05),囊胚自发性皱缩是影响活产的危险因素,囊胚出现自发性皱缩会影响ART的最终结局,导致活产的机会变小。自发性皱缩对近期妊娠结局指标(着床率、临床妊娠率、早期流产率)影响不明显,但对远期妊娠结局(是否活产)影响显著,考虑可能与以下几个方面有关:①滋养外胚层的形态和扩张是预测活产的重要参数[15],囊胚发育时出现自发性皱缩后再膨胀可能会导致胚胎失去水分,损伤细胞之间的连接,导致营养外胚层细胞的功能和结构异常[13-14],最终影响活产。②囊胚自发性皱缩后的再膨胀过程需要大量的能量,胚胎发生自发性皱缩后Na+/K+-ATPase需求量增加[11],能量的过度消耗可能会对胚胎产生有害的长期影响。③自发性皱缩的牛囊胚培养20 h后不能从培养液中吸收葡萄糖,而葡萄糖是体外囊胚发育的必要因素,自发性皱缩对代谢过程产生不利影响,从而对妊娠结局产生负面影响[16-17]。此外,我们还比较了两组间单胎妊娠的新生儿结局,两组间新生儿出生时天数、出生体重、男性新生儿比例均无明显差异(均P>0.05)。两组活产新生儿中各有2例早产,皱缩组单胎妊娠新生儿有1例出生缺陷,为婴儿肾上腺增大;未皱缩组单胎妊娠新生儿无出生缺陷。

综上所述,在冻融移植周期中,囊胚自发性皱缩会降低母体活产率,可以将囊胚是否发生自发性皱缩作为评价囊胚的指标。若患者囊胚数量较多时,尽量不选择发生自发性皱缩的囊胚移植,这样有助于进一步改善冻融周期单囊胚移植的妊娠结局;若患者只有自发性皱缩囊胚可以移植,移植后活产并不会增加围生期不良结局和新生儿缺陷的发生率。在以后的研究中我们期望可以结合TLM准确观察自发性皱缩次数,准确测量囊胚塌陷的程度,以建立囊胚塌陷模式与妊娠结局之间的关系,将人工智能和机器学习模型作为临床妊娠的非侵入性标记物,改进胚胎选择分析的方法,以最终改善患者的妊娠结局。