一株甜瓜枯萎病拮抗菌的筛选、鉴定及生防效果

郝芳敏，董文杰，臧全宇，马二磊，丁伟红，王毓洪

（1.宁波市特色园艺作物品质调控和抗性育种重点实验室·宁波市农业科学研究院 浙江宁波 315040；2.浙江万里学院 浙江宁波 315040）

甜瓜是世界十大水果之一，也是我国广泛栽种的经济作物之一。在甜瓜种植面积不断扩大、产量和经济效益稳步上升的同时，甜瓜病害却日益严重，特别是甜瓜枯萎病、根腐病、蔓枯病等病害，极大地影响了甜瓜的产量和品质，限制甜瓜产业的可持续发展。其中，甜瓜枯萎病由尖孢镰刀菌甜瓜专化型（Fusarium oxysporumf.sp.melonis）引起，是一种土传病害，在甜瓜全生育期均可发生，通常造成瓜田植株大片死亡[1]。甜瓜根腐病和黑点根腐病分别是由腐皮镰刀菌（F.solani）[2]和坎诺单孢菌（Monosporascus cannonballus）[3]引起的土传病害，均可引起根腐病，造成甜瓜藤蔓急性凋萎，严重时甚至绝收。甜瓜蔓枯病是由Stagonosporopsis cucurbitacearum引起的病害，主要危害茎蔓和叶片，该病发病极快，一旦发生蔓延很难控制[4]。由亚洲镰刀菌（F.asiaticum）引起的甜瓜果腐病，多危害半成熟和成熟的果实，发病初期果实呈水渍状病斑，后期内部开始腐烂，该病害初期不易发现，不能够及时进行防治，一旦发生，严重影响果实的品质和产量[5-6]。

目前针对上述病害主要使用传统的化学防治方法，但是会造成环境污染和农药残留超标等问题，对人们的健康及生态环境造成严重的危害，甚至可能导致社会普遍关注的食品安全问题。因此，急需采用高效、无公害的生物技术防治甜瓜病害，生物防治具有安全、绿色、高效等优点，对甜瓜产业的可持续发展具有重要意义。

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是一种革兰氏阴性菌，是植物根际微生态和土壤中的优势微生物种群之一，该菌能分泌多种拮抗植物病原菌的代谢产物[7]，对维持其生态适应性和在复杂的根际环境中繁殖生存有重要意义，可以防治多种植物真菌或细菌类病害，作为新型生物农药已在防治植物病害中广泛应用[8]。而同时对甜瓜枯萎病菌、黑点根腐病菌、蔓枯病菌、腐皮镰刀菌和亚洲镰刀菌同时有效的生防菌较少，因此，筛选对甜瓜不同病原菌同时有效的生防菌株具有重要的理论和实践意义。

笔者的研究在连续多年种植甜瓜大棚的土壤中分离到一株铜绿假单胞菌（P.aeruginosa）Bc1-20，对甜瓜多种病原菌均有抑制作用，平板拮抗活性很强，于是进一步测定了Bc1-20 对甜瓜幼苗的促生作用及甜瓜枯萎病的防治效果，以期为甜瓜病害生防菌剂的开发应用奠定基础，为甜瓜病害的绿色防控提供技术保障。

1 材料与方法

1.1 材料

供试病原菌：尖孢镰刀菌甜瓜专化型（F.oxysporum）TG-5、黑 点 根 腐 病 菌（M.cannonballus）Mc-30、蔓枯病菌（S.cucurbitacearum）MF-17[9]、腐皮镰刀菌（F.solani）NG-3[10]和亚洲镰刀菌（F.asiaticum）Fa-25[11]等5 种，均由笔者实验室分离获得，在PDA 培养基上进行活化，作为供试菌株。供试甜瓜品种为厚皮甜瓜材料48 号，由宁波市农业科学研究院提供，所有试验在宁波市特色园艺作物品质调控和抗性育种重点实验室、宁波市高新农业技术实验园区完成，时间是2023 年4—7 月。

NA 培养基：牛肉浸膏10 g、蛋白胨5 g、葡萄糖20 g、琼脂15 g、水1000 mL，pH 7.0。NB 培养基：牛肉浸膏10 g、蛋白胨5 g、葡萄糖20 g、水1000 mL，pH 7.0。PDA 培养基：马铃薯200 g、蔗糖20 g、琼脂15 g、水1000 mL。

1.2 方法

1.2.1 铜绿假单胞菌Bc1-20 的分离和鉴定 铜绿假单胞菌（P.aeruginosa）Bc1-20 是从宁波市高新农业技术实验园区的连续多年种植甜瓜大棚的土壤中分离得到的，具体做法为：取甜瓜大棚的土壤1 g放到1.5 mL 的无菌水中，混匀，然后稀释涂平板，挑取单菌落在NB 培养基中，温度28 ℃、转速150 r·min-1条件下进行摇培，再次对单菌落进行划线纯化。利用在NB 培养基中28 ℃摇培24 h 的菌液分别对病原菌进行对峙培养，将具有拮抗作用的细菌采用甘油保存在-70 ℃的冰箱内，铜绿假单胞菌Bc1-20 于2023 年2 月14 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.26547。

1.2.2 铜绿假单胞菌Bc1-20 的分子鉴定 铜绿假单胞菌Bc1-20 的分子鉴定过程包括：采用50 μL 的PCR 反应体系进行16S rDNA 的扩增、测序及系统发育进化分析。拮抗细菌的基因组DNA 用全式金细菌基因组试剂盒提取。扩增菌株的16S rDNA 采用细菌通用引物（27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ ； 1492R： 5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）进行扩增[12]，扩增的PCR 产物采用1%的琼脂糖凝胶电泳法检测，对阳性PCR 产物进行纯化、克隆和测序[13]。将测得的16S rDNA 序列在NCBI 数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）进行核酸比对，利用软件MEGA 7.0[14]构建系统进化树，明确拮抗菌的分类地位。

1.2.3 铜绿假单胞菌Bc1-20 的生长曲线和活菌数测定 将铜绿假单胞菌Bc1-20 菌株取出，在NA 平板上划线活化，转代1 次后挑取单菌落接种于NB 液体培养基（100 mL）摇培，在温度28 ℃、转速150 r·min-1条件下摇培，每间隔4 h 取样，直至56 h 结束，取样测量OD600值和活菌数等数据。

1.2.4 铜绿假单胞菌Bc1-20 的防病拮抗效果试验 采用平板对峙法进行防病拮抗菌株的筛选，在PDA 培养基上活化尖孢镰刀菌甜瓜专化型菌、蔓枯病菌、黑点根腐病菌、腐皮镰刀菌和亚洲镰刀菌等病原菌，用直径5 mm 的打孔器在新鲜的菌落边缘打孔，挑取新鲜菌丝块接种在新的PDA 平板中心，用接种环挑取少量新鲜绿假单胞菌Bc1-20 菌液于PDA 培养基的两端划线，划线处距PDA 端部距离为1 cm，封口膜封好后置于25 ℃培养箱中黑暗培养，10 d 之后统计试验结果，每个菌株3 个皿。对照组只接种病原菌，不接种绿假单胞菌Bc1-20[15]。

1.2.5 铜绿假单胞菌Bc1-20 的促生试验 在温室大棚中，利用盆栽试验进行拮抗细菌对甜瓜幼苗的促生试验，在甜瓜种子播种3、7、10 d 后，用拮抗细菌配置的108cfu·mL-1悬浮菌液对甜瓜幼苗进行灌根：用移液器将悬浮菌液沿甜瓜幼苗根部灌入，每棵幼苗用1 mL 菌液处理，共计150 棵，同时以NB培养基处理的甜瓜幼苗作为对照。17 d 后，拔出完整的甜瓜幼苗，每个处理取生长一致的30 棵幼苗，只保留地上部分，测量幼苗的茎粗、茎长、子叶长和宽、每株幼苗中最大真叶的长和宽及地上部分鲜质量，统计分析数据。

1.2.6 甜瓜枯萎病的盆栽生防试验 在甜瓜播种后的3、7、10 d，用108cfu·mL-1的铜绿假单胞菌Bc1-20 悬浮菌液对甜瓜幼苗进行灌根，每棵幼苗用1 mL 菌液处理。每个处理对应1 个穴盘，每个穴盘50 株，设置3 次重复。同时用NB 培养基处理的甜瓜幼苗作为CK 组。

甜瓜枯萎病接种：选用的甜瓜品种为对甜瓜枯萎病感病品种甬148（由宁波市农业科学研究院培育），在2 叶1 心时，以50 株幼苗为1 组，3 次重复，左边一半不接种，右边一半接种。将幼苗从穴盘中取出，轻度损伤根系，洗净根部，在4×106个·mL-1的枯萎病菌孢子液中浸根15 min，根系全部浸入，中间摇动2 次，不接种的在清水中浸根15 min。再移栽至营养土中，接种前3 d 遮阴，温度保持在25 ℃，3 d 缓苗后撤掉遮阳网，在温室正常管理，15 d 后调查发病情况，统计分析病情指数和相对防治效果[16]。鉴定标准：整株无病症为0 级；晴天中午子叶萎蔫或部分子叶、真叶轻微萎蔫为1 级；1 片真叶萎蔫或子叶较重萎蔫为2 级；子叶及真叶萎蔫，阻碍发育为3 级；整株萎蔫，60%以上枯死，心叶成活为4 级；整株严重萎蔫并枯死为5 级[17]。病情指数＝∑（级数×该级株数）/（总株数×最高级数）×100；相对防治效果/%＝（对照病情指数-处理病情指数）/对照病情指数×100。

2 结果与分析

2.1 Bc1-20的分子鉴定及系统发育树分析

从连续多年种植甜瓜大棚的土壤中分离获得1 株对甜瓜病原菌具有拮抗作用的细菌，编号为Bc1-20，其在NA 培养基上可见边缘光滑的圆形、淡绿色菌落，在NB 培养基中进行摇培24 h 后的菌液明显为绿色（图1）。

图1 Bc1-20 在NA 培养基上的菌落形态（A）和在NB 培养基中的摇培情况（B）Fig.1 Colony morphology of strain Bc1-20 on NA medium（A）and was shaken in NB medium（B）

以菌株Bc1-20 的基因组DNA 为模板，用细菌16S rDNA 通用引物进行PCR 扩增，经连接、转化、测序，获得铜绿假单胞菌Bc1-20 的16S rDNA 序列为1500 bp。将测序结果在NCBI 上进行BLAST比对，结果表明其与菌株铜绿假单胞菌（P.aeruginosa）SI1（16S，GenBankAcc.OQ615324.1）的同源性最高，为100%。利用MEGA 7 对测序获得的序列和其他相近的序列进行系统发育树的构建，系统发育树结果表明，菌株Bc1-20 与铜绿假单胞菌（P.aeruginosa）的菌株聚为一支，所以认为Bc1-20 属于铜绿假单胞菌（P.aeruginosa）（图2）。

图2 基于16S-rRNA 构建的拮抗菌株Bc1-20 系统进化树Fig.2 Phylogenetic tree of antagonistic strain Bc1-20 based on 16S-rRNA

2.2 铜绿假单胞菌Bc1-20的生长曲线和活菌数测定

将Bc1-20 按照2%的接种量接种于100 mL 的NB 液体培养基中，每间隔4 h 取样测量OD600值，结果表明，铜绿假单胞菌Bc1-20 在NB 液体培养基中摇培4～20 h 为对数生长期，24 h 后进入稳定期，Bc1-20 在24 h 时的菌落数有7.8×108cfu·mL-1（图3）。

图3 Bc1-20 在NB 中的生长情况（A）和在28 ℃下随时间变化的菌落数（B）Fig.3 Growth curve of Bc1-20 in NB medium over time（A）and change of colony number of Bc1-20 with time at 28 ℃（B）

2.3 铜绿假单胞菌Bc1-20的防病拮抗效果

将铜绿假单胞菌Bc1-20 与甜瓜多种病原菌进行对峙培养，在对峙培养10 d 后，Bc1-20 对尖孢镰刀菌甜瓜专化型（F.oxysporum）、蔓枯病菌（S.cucurbitacearum）、黑点根腐病菌（M.cannonballus）、腐皮镰刀菌（F.solani）和亚洲镰刀菌（F.asiaticum）的生长均有抑制作用，在对峙培养过程中，培养皿中均出现了明显的拮抗带，后期对峙的病原菌也无法再生长。试验结果证明，铜绿假单胞菌Bc1-20 菌株对甜瓜多种病原菌抑制作用明显，具有潜在的生防效果（图4）。

图4 菌株Bc1-20 对甜瓜不同病原菌的平板拮抗试验结果Fig.4 Strain Bc1-20 conducted plate antagonism tests against different pathogens in melon

2.4 铜绿假单胞菌Bc1-20的促生试验

用铜绿假单胞菌Bc1-20 的菌悬液处理甜瓜幼苗，17 d 后进行数据测量，结果表明，其在茎粗、茎长、地上部鲜质量、子叶长和宽及最大真叶的长和宽方面都极显著高于CK，表明铜绿假单胞菌Bc1-20 对甜瓜幼苗有促生作用（图5，表1）。

表1 菌株Bc1-20 对甜瓜幼苗生长的影响Table 1 Effects of strain Bc1-20 on the growth of melon seedlings

图5 菌株Bc1-20 对甜瓜幼苗的促生试验Fig.5 Growth promotion test results of Bc1-20 strain on melon seedlings

2.5 甜瓜枯萎病的盆栽生防试验

用铜绿假单胞菌Bc1-20 处理甜瓜幼苗后，进行甜瓜枯萎病的接种试验，接种15 d 后调查统计，结果表明，铜绿假单胞菌Bc1-20 处理的甜瓜幼苗枯萎病的病情指数为40.80，CK 的病情指数为85.65，用铜绿假单胞菌Bc1-20 处理的相对防治效果为52.34%。由此可见，铜绿假单胞菌Bc1-20 对甜瓜枯萎病具有一定的生防作用（图6、表2）。

表2 Bc1-20 处理相对防治效果Table 2 Relative control effect of Bc1-20 treatment

图6 菌株Bc1-20 对甜瓜枯萎病生防试验Fig.6 Biological control of strain Bc1-20 against melon Fusarium wilt

3 讨论与结论

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是动物和人类的条件性致病菌[18]，但是，近年来，一些用于促生和防治植物病原菌的铜绿假单胞菌陆续被分离和鉴定，由于显著的抑菌活性而引起了研究者的极大关注。例如铜绿假单胞菌31-2 对烟草青枯病菌拮抗活性稳定，可在烟草根、茎和叶表面及内部定殖，对烟草青枯病具有很好的防治作用，菌液和活性物质粗提物分别具有39.50%和20.90%的防治效果[19]。铜绿假单胞菌FJAT-346-PA 对香蕉枯萎病病原菌具有良好的抑制作用，在香蕉组培苗、盆栽苗及大田植株体内定殖，对香蕉有明显的促生长作用，对香蕉枯萎病具有较好的防治效果，盆栽防效和田间防效分别为83.67%和82.00%[20]。铜绿假单胞菌F13 不仅对豆角白粉病具有良好的防治效果，而且具有很好的促生效果，株高、叶片数和茎粗均高于对照组，且产量高于对照组39.68%[21]。在笔者的研究中，铜绿假单胞菌Bc1-20 处理的甜瓜幼苗茎粗、茎长、地上部鲜质量、子叶及最大真叶大小都极显著高于对照，具有一定的促生作用，由于根系在拔出穴盘时容易断根，并没有进行根系强弱的比较。此外，铜绿假单胞菌还对昆虫和线虫具有一定的抑制效果，例如对松墨天牛幼虫具有杀虫活性[22]，铜绿假单胞菌NZM13-11 能够高效地杀死马尾松内的松材线虫，具有防控松材线虫病的可能性[23]。

目前，铜绿假单胞菌在葫芦科作物上的应用比较少，1996 年分离于上海郊区甜瓜根际的铜绿假单胞菌M18 可抑制甜瓜蔓枯菌生长[24]，分泌的抗真菌物质PCA 可以有效防治瓜类枯萎病[25]，使用M18活菌浸种处理黄瓜种子以及在大棚根基土壤浇灌的试验中，黄瓜枯萎病相对于对照降低70%～80%[26]，霜霉病的发病率和病情指数均下降70%左右[27]。笔者研究的铜绿假单胞菌Bc1-20 对尖孢镰刀菌引起的甜瓜枯萎病的相对防治效果为52.34%，但未做对蔓枯病菌、腐皮镰刀菌、黑点根腐病菌、亚洲镰刀菌等病菌引起的其他病害的盆栽防效试验，仍需进一步验证完善。

笔者研究分离获得的铜绿假单胞菌Bc1-20 对甜瓜多种病害病原菌具有抑制作用，包括尖孢镰刀菌甜瓜专化型病菌、黑点根腐病菌、蔓枯病菌、亚洲镰刀菌和腐皮镰刀菌等病原菌；Bc1-20 对甜瓜幼苗有促生作用，包括甜瓜幼苗的茎粗、茎长、鲜质量、子叶长和宽及最大真叶的长和宽方面都极显著高于对照；Bc1-20 对甜瓜枯萎病具有良好的生防潜力，Bc1-20 处理的甜瓜幼苗枯萎病的病情指数为40.80，对照组的病情指数85.65，相对防治效果为52.34%，可很好地防治甜瓜枯萎病。