耐盐碱抗锌菌株的分离鉴定及其特性

王雪琦，范晓丹，张晋璇，韩熠博

（天津城建大学a.环境与市政工程学院；b.天津市水质科学与技术重点实验室；c.环境与市政级实验教学示范中心；d.天津市国际联合研究中心，天津 300384）

随着工业的快速发展，土壤重金属污染问题日益突出.土壤重金属污染是逐渐积累且不可逆的过程，具有隐蔽性、停滞性和破坏性的特点.尤其是土壤中锌含量过高，不仅会对土壤生态系统产生破坏，也会影响农作物的生长，通过食物链危害人体健康[1-2].土壤盐碱化已是一个世界性的难题，会引起植物资源减少、生物多样性减少等一系列生态环境问题[3].盐碱化土壤也面临重金属污染的问题，若采取有效的措施来进行治理，可提高土地利用面积，具有重要的现实意义[4].目前，微生物修复技术起步较晚，但由于其廉价且环保，应用潜力较大，已成为重要的重金属污染修复技术[5]. 微生物修复技术主要通过从污染土壤中分离筛选出高效耐性菌株，对特定的污染物进行去除修复[6-7].

曹礼等[8]在造纸厂排污口分离出一株耐锌浓度为1 000 mg/L 的菌株HXZ-1，对锌有较强的抗性和吸附性；Sedlakova-Kadukova 等[9]筛选出一株极耐锌链霉菌K11，并且发现该菌株对锌积累能力与锌耐受性有关.但是目前关于盐碱土壤的抗锌微生物方面研究还较少，因而筛选耐盐碱抗锌性菌株对于推进盐碱地重金属污染微生物修复技术的深入发展具有重要意义.

本研究在天津市滨海新区工业废弃土壤中分离筛选出一株耐盐碱抗锌菌，对其进行形态学和分子生物学鉴定，研究该菌株的生长特性及其影响因子，探讨菌株的耐盐碱性，为微生物法修复高盐碱锌污染土壤提供理论数据.

1 材料与方法

1.1 土样采集

土样采集于天津市滨海新区工业废弃地，遵循五点采样法，取土壤放置于无菌袋中，储存备用.

1.2 培养基

牛肉膏蛋白胨培养基（g/L）：牛肉膏5.0 g、氯化钠5.0 g、蛋白胨10.0 g、琼脂20.0 g.

LB 固体培养基（g/L）：胰蛋白胨10.0 g、NaCl 10.0 g、酵母膏5.0 g、琼脂10～15 g.

驯化培养基：向LB 培养基中加入一定量的ZnSO4溶液，使其Zn2+浓度达到实验要求.

1.3 土壤重金属含量和盐度

土壤pH 值采用国标土壤pH（NY/T 1377—2007）的方法测定；土壤盐度测定采用土样和去二氧化碳水按1 ∶5 比例均匀混合，过滤后取上清液水浴加热，加入（15%）H2O2，直至黄色物质变为白色，放入干燥箱烘干3 h，计算盐度；土壤样品采用酸微波消解后用火焰原子吸收光谱仪（型号：SensAA F）测定Zn2+含量.本研究用土壤样品的部分理化性质如表1 所示，其属于碱性（7.5～8.5）中盐渍土（0.5%～1.0%），是天津市特有的盐碱土，本文在后续抗锌菌株的分离驯化中重点考虑该土壤的特性.

1.4 耐锌菌株的分离与驯化

取5 g 土样置于45 mL 无菌蒸馏水中，振荡，将振荡均匀的土壤悬液进行梯度稀释；分别取10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7的稀释液涂布于含有Zn2+浓度50 mg/L的牛肉膏蛋白胨培养基上；每个梯度设三组平行，在30 ℃恒温箱中培养，再经接种、纯化，将纯化后的菌株转接到LB 固体培养基；并按照（50，200，500，800，1 100，1 500，1 800 mg/L）锌浓度梯度增加LB 培养基中Zn2+浓度，多次转接、纯化获得单一菌株，测其对Zn2+最小抑制浓度（MIC）为1 500 mg/L.

1.5 菌株鉴定

（1）形态学观察. 挑取单菌落放置于显微镜下观察菌落形态.

（2）ITS 基因序列分析. 提取菌株基因组DNA 作为模板，采用购自上海生工公司的Ezup 柱式真菌基因组DNA 抽提试剂盒（SK8259）操作.使用上游引物ITS1：5’- TCCGTAGGTGAACCTGCGG -3’和下游引物ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’进行ITS片段扩增、凝胶电泳和纯化回收等步骤；将获得的ITS序列通过BLAST 程序与GenBank 中核酸数据比对分析进行菌种鉴定.

1.6 菌株生长特性研究

（1）生长曲线的测定.将对照组（Zn2+浓度为50，200，500 mg/L）和空白组（不加Zn）每组设置3 个平行，将菌株活化24 h，按照加菌量5%接种到LB 液体培养基中培养.每隔一定时间用紫外分光光度计测定其OD600值，绘制不同Zn2+浓度下其生长曲线.

（2）环境因子对菌株生长的影响.在不同的温度、pH 值、盐度条件下（见表2）恒温振荡，每隔一定时间测其OD600值.表2 中每个处理条件设置3 组平行，以未接种的LB 液体培养基作为空白.

表2 菌株生长的环境影响因子

1.7 菌株耐盐碱性

将分离筛选出的菌株在LB 固体培养基上通过设置不同条件，且30 ℃倒置培养72 h，观其生长状况[10].

（1）耐盐性：调节pH=7.0，NaCl 质量分数分别为1%，2%，2.5%，3.0%，3.5%.

（2）耐碱性：设置NaCl 含量为2%，pH=8，9，10，11，12.

（3）耐盐碱性：设置三组不用盐碱度NaCl 为2.5%、pH=10；NaCl 为3.0%、pH=11；NaCl 为3.5%、pH=12.

1.8 菌株对难溶性ZnCO3 的溶解作用

配制LB 液体培养基200 mL，添加难溶性ZnCO3，再挑取菌株进行培养，每隔24 h 取样，测定上清液中Zn2+含量和pH 值.降碱能力根据下式计算，即

式中：η 为菌株的降碱能力，%；pH前为未加入菌株的培养基初始pH 值；pH后为菌株生长繁殖后的培养基pH 值.

2 结果与分析

2.1 耐锌菌株的鉴定

2.1.1 形态学鉴定

菌株在LB 平板上30 ℃培养72 h，如图1a 所示：其菌落较大，呈现乳白色，圆形中间稍有凸起，不透明，有蓬松菌丝纵向蔓延.显微镜下如图1b 所示：菌丝发达，分枝较多；分生孢子梗细长，分生孢子头为穗球形.菌株在LB 液体培养基中30 ℃、150 r/min 振荡培养24 h 后，形成黄色菌丝球，直径在40～80 mm 左右，如图1c 所示.根据图1 菌落及菌丝形态初步判断该菌为霉菌[11].

图1 菌株形态

2.1.2 ITS 基因序列分析

该菌株的基因片段为525 bp，基因序列通过BLAST 检索GenBank 中的核酸序列比对，发现该菌株与Fusarium（镰孢菌属）的同源性达到100%，通过MEGA软件构建如图2 所示的系统发育树（括号中序号：菌株登录号），经鉴定为Fusarium incarnatum（半裸镰孢菌）.

图2菌株的系统发育树

2.2 Fusarium incarnatum 的生长特性

2.2.1Fusarium incarnatum生长曲线

Fusarium incarnatum的生长曲线如图3 所示. 从图中可以看出：0～12 h 生长比较缓慢，处于适应停滞期，OD600都未达到0.2；12 h 开始增速生长，在24～48 h生长和繁殖速度最快，处于对数增长期，其OD600均可达到2.0 以上；48 h 开始变得缓慢且最终趋于稳定生长，继续培养，逐步进入衰亡期. 从图中也可以发现，随着培养基中Zn2+浓度的增加，Fusarium incarnatum的生长速度变缓，生物量有所降低，表明Zn2+对菌株生长有一定的抑制作用，在500 mg/L Zn2+时生长速度最慢，但OD600值在48 h 都可达到2.0 以上，仍能正常生长，说明Fusarium incarnatum对Zn2+有一定的抗性.研究表明，菌株的生长周期对吸附效果有一定的影响[12-13]. 经试验，处于对数生长期的菌株通过处理后吸附的效果明显高于其他时期. 结合生长曲线可知，实验中所需菌株培养到48 h 可以达到最佳的处理效果.

图3 Fusarium incarnatum 生长曲线

2.2.2 环境因子对Fusarium incarnatum生长的影响

温度对微生物生长的影响如由图4a 所示.随着温度的升高，Fusarium incarnatum生长速率呈先增后减的趋势，在15 ℃时生长繁殖速度最慢，其OD600值相较于其他温度都低；随着温度的升高，Fusarium incarnatum生长繁殖速度变快，主要体现在对数生长期，呈现出先增加后减少的趋势；在30 ℃时到达最大生长量，24 h左右OD600值就可达到2.0，而在温度继续增加到35 ℃时，生长速率开始变慢，说明30℃是Fusariumincarnatum最适生长温度[14].

图4 不同环境因子对Fusarium incarnatum 生长的影响

在30 ℃条件下，图4b 和4c 是pH 和盐度对Fusarium incarnatum生长状态的影响.

pH 值对Fusarium incarnatum的生长速率影响如图4b 所示：其波动范围不是很大而且适应范围较宽，pH 值在4～5 时，生长速率慢，对菌株Fusariumincarnatum的繁殖和代谢方式有一定的抑制作用；pH =6 时生长速率较快；在pH=7 时生长速率最大，而随着pH值的继续增加，生长速率开始变得缓慢，但在pH 值在8～9 的范围时Fusarium incarnatum仍能正常生长，在30 h 时OD600值可以达到2.0 左右，说明Fusarium incarnatum在碱性条件下也能很好的生长.

影响Fusarium incarnatum生长的另一因素盐度如图4c 所示.作为微生物生长的必需元素，Cl-的浓度影响菌株的新陈代谢，从图中可知，随着盐度的增加，Fusarium incarnatum的生长速率变慢，盐度在5～10 g/L时生长速率最快，24 h 其OD600值可以达到1.8 以上.盐度在15～40 g/L 的范围时，生长速率相对缓慢，但波动不大，只是生长周期有所延缓.盐度在40 g/L 仍能较好的生长，证明Fusarium incarnatum 对盐度有一定耐性.盐度过低会抑制生长，过高会使细胞因失水而死亡，使菌株的生长受到抑制[15].

综上所述，Fusarium incarnatum的最适生长温度、pH 值和盐度分别为30 ℃、pH = 7 和10 g/L，并且Fusarium incarnatum表现出了很高的耐盐碱性，这对处理特定的高盐碱地重金属Zn 污染有一定的优势.

2.3 Fusarium incarnatum 耐盐碱性分析

在生长因素影响实验中，Fusarium incarnatum表现出了很高的耐盐碱性. 表3 是Fusarium incarnatum在高盐碱性条件下生长状况，从中可以看出，Fusarium incarnatum在盐度1.0%～3.0%之间都能较好的生长，培养3～5 d 时LB 固体培养基上能够看到明显的菌落，在盐度3.5%时仍能正常生长；pH 值在8.0～10.0 范围内同样能够有良好的长势；当pH=11.0 和pH=12.0时也能正常生长，培养基上有菌落长出.这与张建等[16]研究结果一致. 在pH = 10，2.5%NaCl 的培养基中，菌株生长良好；pH = 11，3.0%NaCl 条件下生长正常；而pH = 12，3.5%NaCl 时生长困难，菌落生长速度变慢，5 d 时培养基上只长出了很小的菌体，但仍然够生长，说明Fusarium incarnatum对高盐碱有一定的耐受性.

表3 Fusarium incarnatum 耐盐碱性

2.4 菌株溶解性与降碱性分析

一般地，盐碱地土壤中碳酸锌含量较高，不利于菌株Fusarium incarnatum对Zn2+的吸附去除，菌株对难溶性ZnCO3的促溶作用实验如图5 所示. 结果表明，随着菌株培养时间的延长，培养基中Zn2+含量逐渐增加，同时pH 值也有所降低，说明该菌株对难溶性ZnCO3有较好的活化效应.培养2 d 左右，培养基中的可溶性锌含量大幅增加，pH 值也从开始的8.2 降到6.51，这和菌株的生长周期是相对应的，在对数生长期，菌株生长繁殖能力快，代谢能力强，培养液中可溶性锌含量增加.从2～7 d 开始，培养液中可溶性锌含量增速变得缓慢，最终达到60.58%；pH 值开始稍有变大，7 d 时稳定在6.91 左右，但仍然处于酸性到中性的环境.菌株的降碱性有利于其对难溶锌的促溶作用[17-18]，将难溶态转化为可溶态，有利于后续菌株的吸附去除.

图5 Fusarium incarnatum 溶解性与降碱性

3 结 论

（1）通过梯度驯化筛选出一株耐盐碱地耐锌微生物，经形态学和ITS 序列分析鉴定属于Fusarium incarnatum（半裸镰孢菌）.

（2）Fusarium incarnatum对Zn2+的最小抑制浓度为1 500 mg/L.其生长最适条件为：温度为30 ℃；pH 值为7；NaCl 质量分数为10%.

（3）Fusarium incarnatum耐盐碱性达到3.5%NaCl，pH=12.能够使含难溶性ZnCO3的培养基中可溶性锌含量增加60.58%，有利于在盐碱地对碱式锌的活化，提高生物可利用性，同时可以降低溶液的pH 值，有利于对难溶性ZnCO3的促溶作用.