“温度对酶活性的影响”实验改进综述及思考

程佳佳

(广东省中山市第一中学 广东中山 528403)

《普通高中生物学课程标准(2017年版2020年修订)》(以下简称《课程标准》)在教学建议中提出“组织以探究为特点的主动学习是落实生物学学科核心素养的关键”“实验教学是促成学生达成生物学学科核心素养的重要支撑”。针对人教版教材中利用淀粉酶进行“探究温度对酶活性的影响”的实验,许多教师在具体操作过程中进行了探索,在材料选择、因变量的检测方法、实验操作顺序等方面进行了改进,使实验现象更易解释,现象更加明显。下文以“中国知网”作为数据来源,以“温度对酶活性影响”为主题词搜索相关文献,对该实验的改进进行了综述,并提出了相关改进思考。

1 实验原理

反应底物淀粉在淀粉酶的水解下生成还原糖,可以用碘液检测单位时间内淀粉的消耗量或用斐林试剂检测单位时间内还原糖的生成量,从而表征反应速度。单位时间内产生的还原糖越多,淀粉消耗量越大,酶活性越高。

2 存在的问题

在该实验的具体操作中,存在的问题主要包括以下几方面

(1)选材问题。α-淀粉酶溶解不够充分,浓度控制不够精确,且该酶在0 ℃～100 ℃均有较高的活性。

(2)因变量的检测问题。若利用碘液检测,高温条件下,由于淀粉的螺旋结构遭到破坏,使得其与碘之间的吸附结构无法保持,无蓝色现象产生;在常压下,65 ℃以上碘会升华,高温下不出现蓝色反应。基于以上,根据实验现象无法说明酶的活性是否被破坏。而若选用斐林试剂检测,由于要进行水浴加热,不能保证是预设温度下的反应结果。

(3)该实验为定性实验,无法由数据进行模型构建,需转变为定量实验。

(4)无法回收溶解在淀粉溶液中的酶。

3 改进措施

3.1 改进实验条件

实验条件和是否规范操作对于实验的结果影响很大,甚至会影响实验的成败。朱小碗认为可以选择煮沸后的分析纯可溶性淀粉,因为煮沸不仅可以使淀粉充分溶解,而且可以使不同温度处理后的溶液中直链淀粉含量基本相同。吴蕾研究得出,α-淀粉酶失活的温度为85 ℃以上,失活的保温时间至少应控制在6 min。张进则发现60 ℃左右淀粉酶活性较高。这些探究结果为实验温度范围的选择、梯度设计、无关变量的控制提供了重要依据。

3.2 改进实验材料

3.2.1 选择其他酶

在该反应中,无论是反应物还是生成物的检测,在检测效果上均存在着争议,有研究选择其他酶来探究温度对酶活性的影响。姚舒等根据美国教材的建议,选择儿茶酚溶液代替淀粉溶液,利用分光光度计进行反应程度的定量分析。尹辉发现,使用鸡蛋溶液在60 ℃水浴加热后过滤所形成的浑浊鸡蛋花溶液,再利用胃蛋白酶水解,反应迅速,现象明显,可作为替代材料。张巍波选择胰蛋白酶和脱脂奶,并结合分光光度计以定量确定酶的相对活性。和渊等用纯度较高且纯化较好的蛋白酶,结合电泳技术以判断酶活性的强弱。赵行星通过实验发现:糖化酶(α-1,4-葡萄糖水解酶)对温度有较高的敏感性(65 ℃以上活性迅速下降)且对淀粉有适中的催化作用,能够替代α-淀粉酶。

对酶的种类的拓展,可丰富学生对于生命多样性和复杂性的认知,树立生命观和结构观。同时,在新情境下,教师引导学生自主设计并完成实验,可以训练学生的科学思维和探究能力,助力核心素养的落实。

3.2.2 固定化酶

沈唯军以海藻酸钠为载体,采用包埋法固定α-淀粉酶。使用固定化酶不仅节约成本和用时,由于固定化酶可与产物分离并重复利用,可以让学生对“高温对酶空间结构破坏的永久性”这一论述进行验证。

3.3 改进因变量的检测方法

围绕反应物淀粉和产物还原糖的检测,改进的方向包括两方面,一是排除检测方法和试剂对自变量带来影响,使定性检测更加科学可信;二是由定性检测发展为定量检测,《课程标准》中提出:“在重视定性实验的同时,也应重视定量实验”,将定性实验发展为定量实验,是实现思维进阶,培养高阶科学思维素养水平的路径之一。

3.3.1 检测还原糖的生成量

在定性观察中,罗建义建议先将各预设温度条件下的淀粉和淀粉酶溶液装入半透膜做成的透析袋(淀粉和淀粉酶无法通过)中,收集透析液(含有反应产物还原糖)后再用斐林试剂进行检测。该改进破除了“水浴加热会改变原有温度,改变预设的酶活性,因而不能用斐林试剂进行检测”的固化思维,为实验提供了更多思路,有利于在解决问题的过程中发展学生的科学探究能力。

在定量检测中,柯文汇利用还原糖与DNS 试剂(3,5-二硝基水杨酸,黄色)可发生氧化还原反应生成3-氨基-5-硝基水杨酸(棕红色)的原理,利用分光光度计检测540 nm 波长下的吸光度值,实现还原糖含量的定量检测。但该反应需要预实验确定合适的淀粉溶液和酶溶液浓度、保温时间和显色时间等反应条件,操作较繁琐。以该显色反应为基础,蓝益添利用数码成像比色法定量测定麦芽糖含量。其原理是利用数码摄像头拍摄有色待测溶液的照片,再利用颜色识别软件如Photoshop 采集该溶液的颜色参数,发现颜色参数M 值与麦芽糖含量呈正相关,可用M值表示麦芽糖含量。

3.3.2 检测淀粉的消耗量

在定性观察中,胡四新将各组反应后的溶液均至于冰水中再进行检测,排除了高温下淀粉结构变化导致遇碘不变蓝的问题。

在定量检测中,李巧灵等通过定时取样、滴加碘液和观察颜色,测定相应温度下达到和碘液相同颜色的时间t,并用1/t反映相对酶活性,实现了定量的观察。李金月等利用色度传感器测定淀粉与碘液显色反应的色度,从而定量比较不同温度条件下淀粉酶活性,该技术具有便捷、准确、实时、综合和直观等特点,但是由数据采集器、传感器和计算机及配套的软件组成的定量采集数据实验技术系统较难推广应用。沈唯军等利用分光光度计检测620 nm 处淀粉与碘液反应形成蓝色物质的含量,进行不同条件下淀粉酶活性的比较。苏锦权巧妙地用智能手机的光线传感器来测量溶液的吸光度,再利用手机软件“亮度计”读到的数值表征酶活性,从而在课堂中快速获得实验证据。

利用分光光度计,亮度计等技术和方法进行数据采集需要教师引导学生理解相应检测原理,在合理引导的基础上使学生养成综合、开放、创造性思维的习惯,但由于对学生仪器操作要求较高,不易在中学开展。

3.4 实验材料的整合

教材建议在探究pH 及温度对酶活性影响的实验中分别选择过氧化氢和淀粉作为反应物,但在真正的操作中需要更换实验材料,准备工作繁琐,难以在一个课时完成实验内容。有研究者就对实验材料进行了验证,以探究淀粉酶能否用于pH 影响酶活性的实验。

宗海凤等发现在碱性条件下,用碘液检测反应体系,结果不变蓝,通过一系列的探究实验发现,若选择碘液作为鉴定试剂,碘液会与碱性物质发生反应生成次碘化钠(NaIO)和碘化钠(NaI),反应无法进行;若选择斐林试剂作为鉴定试剂,则斐林试剂中的NaOH会与酸性物质发生酸碱中和反应。因此不能用淀粉酶探究pH 对酶活性的影响。

对此,陈九云等在实验中减少了酸和碱的用量,在3 mL 反应体系中,分别使用1 滴5%的HCl 溶液和1 滴5%的NaOH 溶液,发现既可有效地使酶失活,又不影响淀粉及降解产物的正常检测,从而解决了碘液鉴定和斐林试剂鉴定对实验结果带来的误判。此外,他们认为在减少盐酸用量的基础上,酸对淀粉水解的影响可以忽略不计,因此可以用淀粉酶探究pH 对酶活性的影响。

4 实验改进思考

当利用淀粉酶作为实验材料时,邓纯臻等利用半透膜和U 型管设计如图1所示的装置,可直观地根据液面高度变化反映酶活性。在此基础上稍加改进,细化温度梯度之后,通过测量液面的高度差,即可进行定量分析。改进后的装置无需进行复杂的试剂检测,并且融合了多个知识和技能,实现了知识的迁移和问题导向的科学研究。

此外,本实验操作繁琐,通过合理设计实验装置,使各个温度下的实验可以同时进行,大大缩短实验时间。金慧玉自制了温度梯度恒温水浴锅(图2),拓宽了改进的思路。但在该装置中未解决如何让不同组别酶和底物分别保温后同时混合的问题,还需进一步改进。

脲酶也可以作为一种补充材料替代淀粉酶,其最适温度在50 ℃左右,70 ℃以上失活。脲酶分解尿素产生二氧化碳和氨,氨溶于水可以使酚酞变红,根据一定时间内酚酞变红的程度即可定性反映酶活性,而利用CO2感应器测量反应过程中CO2的变化情况即可定量反映酶活性。脲酶和尿素价格便宜,成本较低,同时其作为第一个被鉴定为蛋白质的酶,对其进行更深入的了解有助于科学史的深入研究,有助于学生科学思维的形成。

“温度对酶活性的影响”这一探究实验的改进和创新是多方面、多层次的,可以挖掘的知识还有很多,研究工作还有待进一步加强。对该实验有效的把握,可以帮助教师创造有效的教学情境,激发学生的学习热情,从而培养学生不断探索、勇于创新的科学精神,实事求是的科学态度以及终身学习的能力。