WEE2调控卵母细胞减数分裂的机制及其不孕突变的研究进展

张安妮,刘阿慧,张学红

胚胎发育的关键在于正常受精,然后才开始早期有丝分裂[1]。然而,在辅助生殖助孕过程中部分患者表现为反复受精障碍[2]。2018年Sang等[3]首次报道了WEE2基因突变导致的反复受精失败,强调了WEE2基因在卵母细胞成功受精过程中发挥的重要作用。本文重点总结WEE2基因的定位、结构、功能,及其与不孕突变相关的研究进展,探讨WEE2在卵母细胞减数分裂中的分子作用机制。

1 WEE2调控卵母细胞减数分裂的机制

1.1 WEE2基因的功能

WEE激酶蛋白家族包括3个成员:WEE1、MYT1和WEE2[4]。WEE1作为从属于丝氨酸/苏氨酸家族的蛋白激酶,编码含647个氨基酸的蛋白质,定位于细胞核,是细胞周期G2/M 检查点的关键调控因子,通过磷酸化周期蛋白依赖性激酶1(cyclin-dependent kinase 1,CDK1)的第15位酪氨酸实现G2/M期阻滞,为DNA修复提供时间[5]。MYT1是一种特殊的神经转录因子,在中枢神经系统发育过程中发挥作用,与其相关的疾病包括室周白质软化症和科芬-西里斯综合征9型。此外,定位在细胞质的MYT1以膜结合激酶的身份抑制细胞周期推进[6-7]。

WEE2基因作为WEE1基因的同源体,也称为WEE1B,编码的卵母细胞特异性蛋白酪氨酸激酶是WEE激酶蛋白家族中高度保守的一员[8]。WEE2蛋白由567个氨基酸组成,分子量为62 kD,其在人体组织中首次发现于男性睾丸,后因多种研究指明WEE2在维持小鼠卵母细胞减数分裂停滞方面发挥重要作用,且依赖母体表达而将其归类为母源性基因[9],后已证实与卵母细胞反复受精失败密切相关[4]。WEE2在卵母细胞减数分裂周期中稳定存在,参与生发囊(germinal vesicle,GV)阶段停滞、中期退出和原核形成的过程,其定位随功能需要而发生“核浆转位”的变化,表达水平在受精后急速下降。WEE2的功能在不同物种之间高度保守,可通过磷酸化细胞周期蛋白2(cell division control protein 2,Cdc2)的酪氨酸(tyrosine,Tyr)第15位点以抑制Cdc2活性,从而抑制细胞周期蛋白B1-细胞周期蛋白2复合物(又称成熟促进因子,mature promoting factor,MPF)活性。正常受精卵内含父源、母源两个原核,WEE2突变后MPF活性过高会导致患者原核形成失败、受精障碍。

1.2 WEE2在不同物种卵母细胞减数分裂时期的定位

哺乳动物的卵母细胞在胎儿期启动第一次减数分裂且停滞在GV时期。促黄体生成素(luteinizing hormone,LH)峰在排卵前作用于卵泡体细胞并促进减数分裂的恢复,该过程以生发泡破裂(GV break down,GVBD)作为形态学标志[10]。进入第一次减数分裂中期的卵母细胞染色体逐渐排列整齐,等纺锤体完成组装并迁移至皮质区后开启第一次减数分裂后期[11]。待第一极体排出后卵母细胞进入第二次减数分裂,再次阻滞在分裂中期。随后,在精子进入排卵期卵母细胞卵浆后,钙振荡启动了卵母细胞激活过程,包括皮质颗粒胞吐、通过皮质反应阻断多精子、第二次减数分裂、遗传物质复制、第二极体排出和原核形成等事件[12]。

Nakanishi等[13]通过Northern印迹分析方法检测WEE2 mRNA在正常人体组织中的分布,发现其在睾丸中的含量最丰富。女性WEE2 mRNA仅在成熟卵母细胞中表达,且其水平在受精后立即下降[14]。WEE2蛋白在细胞核与细胞质中均有分布,且突变常影响WEE2在核浆之间的运输。近年来相继证实WEE2在小鼠、猪和恒河猴等不同物种卵母细胞中存在且以相似机制调节减数分裂[15]。马浚仁等[16]研究发现内源性WEE2 mRNA 在小鼠卵母细胞受精后的各个时期均有表达,WEE2蛋白活性随着细胞周期的进程而变化,在G1期保持平稳,进入S期后表达逐渐增高,随后在M期迅速下降。G1期和S期WEE2蛋白主要集中分布于细胞核,在G2期弥散分布于细胞浆,在G2末期至M期又重新分布于细胞核。显微注射外源性WEE2 和细胞分裂周期蛋白25B(cell division cycle protein 25B,CDC25B)至小鼠卵母细胞细胞质中,结果提示二者在调节过程中存在“核浆转位”,且具体定位与内源性WEE2分布相同。后续研究证实,核输出信号(nuclear export signal,NES)和核定位信号(nuclear localization signal,NLS)是此转位实现的结构基础,为调控小鼠卵母细胞减数分裂过程所必需[17]。

Shimaoka等[18]检测了WEE2在猪组织细胞中的定位,结果显示猪的WEE2基因存在NLS和NES,并在减数分裂停滞的卵母细胞中发现了其唯一的核定位。核定位可能用于维持WEE2的区域高浓度,在该机制下仅需少量WEE2即可发挥维持卵母细胞减数分裂停滞的全部功能。Hanna等[4]用长双链RNA干涉下调恒河猴WEE2基因的表达,结果显示卵母细胞重新开始停滞在GV期的减数分裂,检测结果表明WEE2 mRNA主要表达于恒河猴卵巢内的卵母细胞,含量随排卵进程而累积;而在睾丸中含量微小。WEE2蛋白在GV完整卵母细胞中有特定的核定位,通过降低cAMP浓度的方式抑制非人灵长类动物卵母细胞的减数分裂进程。

1.3 WEE2调控卵母细胞阻滞与恢复的机制

WEE2在卵母细胞的成熟中发挥着重要作用。受精过程的完成依赖于卵母细胞的成熟,哺乳动物卵母细胞经历两次阻滞后方可成熟,首次阻滞在排卵前的减数分裂I期(meiosis phase I,MI),MI完成后卵母细胞进入减数分裂II期(meiosis phase II,MII),再次阻滞后完成受精。WEE2基因主要在GV期停滞、MII中期退出和原核形成过程中通过参与从PKA到MPF的信号通路来调控减数分裂[19-20]。

1.3.1 WEE2在GV期停滞中的作用 GV期WEE2作为独特的卵母细胞特异性激酶,以失活Cdc2的方式抑制MPF,维持第一次阻滞。WEE2介导的Cdc2去磷酸化对MPF失活至关重要[21]。MPF由催化亚单位CDK1/ CDC2和调节亚单位细胞周期蛋白B(Cyclin B)组成,是目前人们普遍接受的“细胞周期发动机学说”中的核心部件,MPF的调节主要通过WEE2是否磷酸化tyr15从而抑制CDK1/CDC2活性来发挥作用[22]。

1.3.2 WEE2在MII期退出、原核形成中的作用 在小鼠及人类卵母细胞中,若WEE2下调,MPF的升高会导致MII期退出及原核形成的失败,导致受精失败。受精后人类WEE2主要参与MII期卵母细胞阻滞的恢复。精子诱导卵母细胞进行一系列Ca2+振荡后钙离子浓度急剧升高,钙调蛋白依赖性蛋白激酶(CaMKII)被激活从而磷酸化激活静息状态的WEE2。活化WEE2通过磷酸化Cdc2的第15位酪氨酸使其活性降低导致MPF失活,使得卵母细胞完成MII期退出及原核形成的过程。

WEE2可通过CaMKII的磷酸化效应激活,也有部分磷酸酶如细胞分裂周期蛋白25A(cell division cycle protein 25A,CDC25A)和CDC25B等使其失活。相关研究表明,CDC25B通过去除由WEE激酶家族催化的抑制性磷酸化来激活MPF,促进细胞周期进程,是小鼠卵母细胞减数分裂的关键启动因子。PKA是一种cAMP依赖性丝氨酸/苏氨酸激酶,可以通过平衡WEE2激酶和CDC25磷酸酶活性来形成MPF活性的双向调节环,其活性降低会导致WEE2无法磷酸化而失活,抑制了CDK1活性同时激活MPF,导致后续GVBD、减数分裂恢复等步骤的失败[23]。因此,维持高水平活性PKA在减数分裂中很重要[24]。在哺乳动物的卵母细胞中,高浓度的环磷酸腺苷(cAMP)使减数分裂停滞在MI前期的双线期[25]。排卵前LH峰触发卵泡信号极联,降低卵浆cAMP水平从而导致PKA失活,导致CDC25B转移到细胞核,积累的CDC25B可导致穿梭到细胞核中的MPF碎片的去磷酸化和活化[13]。活化的MPF促进WEE2转移至细胞质。WEE2的易位进一步促进核MPF的激活。随后,CDC25B可能从细胞核转移到细胞质,WEE2也从细胞质转移到细胞核。两者的相互易位是卵母细胞第一次分裂的先决条件,这种核浆转位受 PKA失活及MPF活化调节。后期细胞周期蛋白B降解促使MPF失活,失活的MPF强制执行Ca2+指令,减数分裂恢复,停滞在MII的卵母细胞继续成熟[26]。自此原核形成、合子发育、胚胎细胞的有丝分裂开始进行[26]。

2 WEE2在不孕突变中的研究进展

在Sang等[2]2018年的实验研究中,4名女性的反复受精失败具体表现为卵母细胞原核形成障碍,但在卵胞浆内单精子显微注射(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)术后第二极体均可正常排出。这项研究首次显示WEE2突变与人类低受精率事件之间的关联,确定了4种遵循孟德尔常染色体隐性遗传模式的4种纯合突变表型,分别为p.Asp234His、p.Thr493Asnfs*39、p.His337Tyrfs*24和p.Glu75Valfs*6,受影响个体均存在纯合子功能缺失突变或纯合子移码蛋白截短突变。在后续研究中注射WEE2 RNA后的突变卵母细胞可成功受精并形成囊胚[3]。目前已报道WEE2与受精失败相关的22个突变,包括移码、剪切、缺失等,WEE2突变在完全受精失败(total fertilization failure,TFF)病例中起重要作用。但WEE2在人类受精过程中的机制尚不完全清楚,需要确定新的突变。

刘顿等[27]报道了世界首例WEE2基因纯合突变的男性案例,通过全外显子测序技术鉴定了WEE2在c.G585C(p.K195N)位点的纯合错义突变,证实该基因突变仅影响女性生殖,对男性生育无不良影响;且杂合子不致病,唯纯合突变导致卵母细胞受精障碍。目前并没有证据表明WEE2变异和男性不育相关,只有一项研究假设,WEE2 反义RNA1(WEE2-AntiSense RNA 1,WEE2-AS1)的增加可能会下调WEE2表达,从而改变精子成熟的自然时间,增加异常精子细胞的数量[28]。

ICSI已成为通过体外受精治疗各种形式的男性因素不育和先前周期受精失败最有效的方法[29]。目前,改善ICSI后某些受精失败病例结局的方法有人工卵子激活术(artificial oocyte activation,AOA)[30]。Zhao等[28]报告ICSI-AOA无法挽救存在WEE2突变女性患者的反复受精失败,因此确诊携带突变的女性可以避免ICSI或ICSI-AOA的重复治疗。此外,有研究将WEE2 RNA注射到具有WEE2突变患者的卵母细胞中,可在体外成功受精以及形成囊胚[3]。但考虑由于注射后卵母细胞中转录的蛋白质数量尚不确定,胚胎质量可能会受到影响等其他生物安全因素,其在临床中的应用仍有待进一步探索。

3 小结

本文系统分析总结了WEE2基因在不同物种卵母细胞减数分裂各时期的定位情况,及其在卵母细胞GV期停滞、MII期退出和原核形成过程中的作用及相关机制,不仅为原核形成失败患者的基因诊断揭示了一个潜在的靶点,而且为不孕症女性的治疗提供了遗传咨询证据。