人卵巢组织玻璃化冷冻及移植的影响因素分析

胡方方,李延,崔趁趁,赵冰,张翠莲,梁琳琳*

近年来,恶性肿瘤治疗技术的进步改善了患者的远期预后,但放化疗对卵巢功能的损伤已成为新的焦点问题,越来越多的育龄期女性患者开始重视治疗后的生育力保存。女性生育力保存包括胚胎冷冻、卵母细胞冷冻及卵巢组织冷冻,其中,胚胎及卵母细胞冻存技术已近成熟,但不适用于儿童、未婚女性及迫切需要治疗的肿瘤患者。卵巢组织冷冻保存是继胚胎和卵母细胞冷冻技术之后的另一重大突破,其保存方法主要包括慢速程序化冷冻和玻璃化冷冻。慢速程序化冷冻是较为常见的卵巢组织冷冻方式,目前应用卵巢组织冷冻移植技术出生的婴儿多来源于此方法。玻璃化冷冻是指在液氮中迅速降温,利用高浓度冷冻保护剂将细胞内液态转化为似玻璃状的非晶体化固体状态。鉴于玻璃化冷冻操作简便及成本低的特点,其正在逐步试用于临床实践。目前卵巢组织冷冻及移植过程中仍存在许多挑战,例如如何降低冷冻及移植后组织的缺血再灌注损伤。本文就人卵巢组织玻璃化冷冻(组织形态、冷冻保护剂和冷冻载体)和移植过程(移植部位、卵巢血运、氧化应激和临床因素)中可能存在的影响因素进行分析,以期为女性生育力保存项目提供参考方向。

1 组织冷冻

工作人员通过手术方式取得卵巢组织,去除髓质后切割成块,得到片状卵巢皮质,再经冷冻保护剂渗透脱水后冷冻储存起来,此过程中的每一环节都会影响最终的冷冻效果。

1.1 冷冻保护剂

冷冻保护剂(cryoprotective agents,CPAs)可调节细胞内外渗透压、诱导细胞脱水及减少胞内冰晶形成等。根据其渗透原理,可分为渗透性CPAs和非渗透性CPAs。渗透性CPAs包括亚砜类、醇类、酰胺类及甘油等;而非渗透性CPAs包括蔗糖、海藻糖及聚乙烯吡咯烷酮等。二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)和乙二醇(ethylene glycol,EG)是目前最常用的冷冻保护剂。Whaley等[1]研究发现,低浓度(5%)的DMSO具有增强细胞膜渗透性和抗氧化活性的特点,而在高浓度(40%)时DMSO则转为促氧化特性,诱导细胞损伤。Westphal等[2]研究发现,将牛卵巢皮质分别在10%DMSO和EG冷冻保护剂中渗透、冷冻、解冻后在体外培养,10%DMSO冷冻组葡萄糖摄取率与新鲜组无差异(均为20%～25%),EG冷冻组低于新鲜组(10%～15% vs 20%～25%,P<0.05),说明10%DMSO能够充分保护卵巢皮质免受冷冻损伤,EG对皮质有一定的保护作用,但效果低于DMSO。为降低保护剂的使用浓度,常在渗透性保护剂中添加非渗透性成分,如蔗糖、海藻糖等。多数研究发现,10%～20%(v/v)DMSO+10%～40%(v/v)EG+0.2～1 M蔗糖是人卵巢组织玻璃化冷冻较为适用的联合方案[3-4],部分还添加人血清白蛋白、甘氨酸等成分。

1.1.1 抗冷冻损伤物质的添加 近年来,有学者尝试在冷冻保护剂中添加抗氧化剂、抗冷冻蛋白(anti-freeze protein,AFP)、L-脯氨酸低聚物(L-proline oligomers,L-Pron)等物质减轻冷冻损伤。褪黑素作为一种抗氧化剂,在冷冻过程中可减少活性氧对卵泡的损害。Liu等[5]研究发现,将褪黑素加入小鼠卵巢组织冷冻保护剂中,解冻后0.1 mM褪黑素处理组的原始卵泡率优于冷冻对照组(56.1% vs 26.0%,P<0.05)。目前褪黑素已用于卵巢组织、精子及卵母细胞冷冻。白藜芦醇作为一种天然活性多酚化合物,具有抗炎、抗肿瘤、强抗氧化和自由基等特性,Wang等[6]研究表明,将白藜芦醇加入小鼠的冷冻保护剂中,解冻后该处理组正常形态的原始卵泡率是对照组的2倍(P<0.05)。AFP能够控制细胞外冰晶生长和保护细胞免受冷冻损伤,而与AFP具有相同聚脯氨酸II螺旋结构的L-Pron应用于卵母细胞的冷冻保护剂中,发现有相似作用。Qin等[7]在小鼠的冷冻保护剂中加入50 mM L-Pro8,发现卵母细胞存活率提高至99.11%,且处理组细胞外冰晶的生长速度减慢。除此之外,Tian等[8]研究发现,将海藻盐水凝胶包裹的小鼠腔前卵泡进行玻璃化冷冻,在降低冷冻保护剂浓度情况下依然约有90%腔前卵泡存活。Rodrigues等[9]研究发现,在玻璃化冷冻过程中使用海藻酸盐水凝胶封装斑马鱼卵巢组织,与无封装的冷冻保护剂对照组相比,含冷冻保护剂封装组和冷冻保护剂浓度减半的封装组中丙二醛含量低且无差异[(39.4±4.5) nmol MDA/mg vs (40.5±3.3) nmol MDA/mg,P<0.05]。丙二醛是一种被用作反映氧化应激的生物标志物,通常用于测量脂质过氧化的生成量,说明海藻酸盐水凝胶封装技术不仅能降低冷冻保护剂的使用浓度,而且能保持膜的完整性。目前,尚无有关海藻酸盐水凝胶封装人类卵巢组织的报道,未来在冷冻过程中是否能利用海藻酸盐水凝胶封装卵巢组织以减轻氧化损伤值得进一步探索。

1.1.2 渗透平衡温度及时间的控制 卵巢组织在冷冻保护剂中的渗透效果与所处的温度及时间有关。目前,有关渗透平衡温度对卵巢组织玻璃化冷冻效果的研究较少,主要是在室温下进行。Lee等[10]研究发现,将人卵巢组织在室温下暴露于20% DMSO、20% EG和0.5 M蔗糖中渗透,经玻璃化冷冻及解冻后移植到免疫缺陷小鼠体内,发现移植物有新生血管形成且保留了形态完整的原始卵泡。Zhao等[11]将人卵巢组织在室温下依次暴露于不同冷冻液中平衡(7.5% DMSO和7.5% EG、15% DMSO和15% EG),经玻璃化冷冻及解冻后移植到免疫缺陷小鼠体内,冷冻组与新鲜对照组在卵泡活力方面无明显差异(15.3% vs 11.6%,P>0.05)。而有关卵巢组织在冷冻保护剂中平衡时间的研究,渗透时间范围为2～20 min,Mouttham等[12]将猫卵巢皮质暴露于CPAs的时间从2 min提高到10 min,明显改善了冷冻后的卵泡形态。Behl等[13]比较了人类卵巢组织在冷冻液中不同暴露时间(5 min、10 min、15 min)后对卵泡的影响,发现10 min组拥有更高的卵泡存活率(分别为3.6%、34.7%、13.8%)和更低的凋亡率(分别为52.1%、31.5%、53.1%)。在实际临床工作中,渗透平衡时间与保护剂类型、平衡温度、组织样本厚度以及冷冻载体类型均有相关性。综上所述,渗透温度及时间的选择需要根据患者卵巢皮质的具体情况制定合理的个性化方案。

1.2 冷冻载体

在玻璃化冷冻过程中,冷冻载体是装载细胞或组织的装置。冷冻载体的选择应考虑降温速率、生物安全性和经济等方面。根据卵巢组织是否与液氮直接接触分为封闭式和开放式载体。封闭式载体不直接与液氮接触,保证了生物安全性;其材料多由聚丙烯材质合成,化学及温度稳定性强,可耐受低温,但传导性差,降温速率较慢。近年来,学者开始研究金属材质的封闭式冷冻载体,以期改进传统塑料载体的缺陷。目前,用于人卵巢组织冷冻载体的金属材质主要有银制[14]、不锈钢[15]、钛类[16]等,冷冻后均保留良好的原始卵泡形态。开放式载体直接与液氮接触,降温速率快,但无法避免组织污染的风险;目前有针浸式载体、细胞筛网、冷冻麦管、冷冻环及商品化载体等。Xiao等[17]设计的新型针浸式载体,以针灸针承载组织,减少了冷冻保护剂残留造成的毒性损伤,改善了载体与组织接触面积过大导致冷却速率慢的问题。Sugishita等[15]将用于人卵巢组织的封闭式和开放式载体在冷冻效果方面进行比较,发现两者原始卵泡密度无明显差异[(16.3±15.2) mm3vs (15.9±14.9) mm3,P>0.05]。由于液氮处于完全开放的环境,使用开放式冷冻载体会不可避免地遭到微生物污染,尽管已有文献证明液氮经紫外线照射后能够安全地冷冻人卵母细胞或胚胎[18],但因为无法完全隔绝生物污染等风险,其安全性依然存在隐患。未来在冷冻载体的研发上,在材料方面可以考虑采用银、金等传导性能好的金属材质;在设计方面,盛放组织的载杆部分以中空或网格状代替密封式,减少冷冻保护剂残留,以期改善降温速率与低毒性兼顾的问题。

1.3 组织形态

卵巢组织形态是影响玻璃化冷冻效果的主要因素之一。组织形态主要包括形状、大小及厚度。临床工作者常将组织切割成条形、正方形或碎片状。Diaz 等[19]总结了多个国家生殖中心所采用的卵巢组织大小,即① 条形:长宽分别为5～30 mm和1～20 mm;② 正方形:长宽均为5～10 mm;③ 碎片状:长宽分别为0.5～4 mm和0.3～3 mm;在移植后比较了三者的妊娠率(81.3% vs 45.5% vs 66.7%),发现条形组织的冷冻及移植效果更好。

目前,卵巢组织冷冻主要采取小皮质片冷冻(面积:≤1 cm2,厚度:1～2 mm),较大的组织在渗透效果和实验室储存方面存在局限;而较小组织如碎片状,虽然冷冻效果优于大块皮质,但其本身因卵泡储备不足的问题会影响后续移植效果。Zhao等[11]验证了人卵巢组织大面积(面积≥1.8 cm2)冷冻的可行性,组织在经玻璃化冷冻后未出现明显的冰晶且保留了约79.6%形态正常的原始卵泡,这种比率符合其他文献所述的冷冻后保留70%～90%原始卵泡的数据[19]。

厚度不仅关系到冷冻保护剂的渗透效果,还影响后续移植中的新生血管形成。常见的组织厚度为1～2 mm。 Revel等[20]采用卵巢微器官法将人类卵巢组织切割成厚度仅为350 μm的碎片,研究发现在移植后碎片组织分泌更多的血管生成因子,在3～4天内即能形成毛细血管网,且≤1 mm的厚度能确保氧气及营养物质的均匀扩散。

2 组织移植

移植后卵巢功能恢复受到多种因素的影响,如移植部位的选择、卵巢血运的重建等,这些因素在一定程度上会干扰移植后卵巢组织的生物学功能。

2.1 移植部位

卵巢组织移植部位关系到卵巢血运与卵泡微环境的重建,组织移植根据供受体关系分为自体移植、异体移植和异种移植。

2.1.1 自体移植 自体移植,即自身组织再次移回本体,根据移植部位又可分为原位移植与异位移植。原位移植是将卵巢组织移植到卵巢窝或盆壁腹膜袋等盆腔内部位。因解剖结构上与原有结构相似,利于卵泡发育,增加了自然受孕的可能。2004年Donnez等[21]报道了第一例卵巢组织原位移植的成功案例,该霍奇金淋巴瘤患者在原位移植后5个月恢复了卵巢功能并生育1女。异位移植主要选择盆腔外结构,常见于腹壁、前臂及腋窝等皮下部位,此外还有肾被膜、腹膜及乳房等部位。相较于原位移植,异位移植解剖部位表浅,更利于卵泡监测和卵母细胞收集。Tammiste等[22]报道了一名28岁乳腺癌患者在性腺毒性治疗前接受卵巢组织玻璃化冷冻,后移植到骨盆外侧壁,经体外受精-胚胎移植技术顺利生育2子。Demeestere等[23]比较了人卵巢组织原位及异位移植后卵泡生长情况,卵巢原位、皮下和腹膜在同时期超过15 mm的卵泡分别占64%、29%和7%,可见卵泡发育优先在卵巢原位。综上所述,在考虑卵泡发育环境和后续生育的经济成本方面,原位移植更为适合。若患者存在各种因素导致无法原位移植的情况,可选择异位移植并借助辅助生殖技术获得临床妊娠。

2.1.2 异体移植 当存在各种无法冷冻保存自身卵巢组织或卵母细胞的因素,如卵巢早衰,患者若想恢复生殖与内分泌功能,建议考虑同种异体移植。有研究表明,将基因不同但人类白细胞抗原相容的同卵双胞胎女性进行卵巢同种异体移植,在无免疫抑制治疗情况下于移植6月后恢复了内分泌功能[24]。但该方法因存在免疫排斥反应和伦理等相关问题未能在临床推广。

2.1.3 异种移植 由于伦理问题尚未解决,异种移植目前仅处于观察卵泡发育和评估冷冻移植影响因素的试验阶段,并且若以保存生育力为目的分离其他物种体内移植物中的成熟卵母细胞经辅助生殖技术获得后代,可能存在病原体感染的风险及改变配偶基因型的危险性。

2.2 卵巢血运

与冷冻损伤相比,移植后缺血缺氧对卵巢储备的损伤更大。因此,促进新生血管形成是亟待解决的环节。目前关于促进卵巢组织移植后血管生成的研究进展有:① 促血管生成生长因子,如血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)通过与酪氨酸激酶受体结合,促进内皮细胞增殖;碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)通过增强bFGF和VEGF受体并促进内皮细胞迁移至缺氧部位以促进新生血管形成。Cacciottola等[25]研究发现,在小鼠卵巢组织自体移植时分别添加VEGF、bFGF和两者联合给药,3组均促进新生血管形成,且联合给药组明显提高卵泡存活率。② 鞘氨醇-1-磷酸(sphingosine-1-phosphate,S1P)是由红细胞内鞘氨醇激酶催化鞘氨醇合成,能够保护玻璃化后卵巢移植物免受缺血再灌注损伤,促进新生血管生成[26]。③ Z-VAD-FMK是一种能够渗透细胞的半胱天冬酶抑制剂,可抑制由半胱天冬酶激活导致的细胞凋亡。研究表明,在异种移植前向小鼠体内注射Z-VAD-FMK可改善移植后血管生成、促进卵泡增殖以及减少颗粒细胞凋亡[26]。④ 两步法方案,有研究表明,在移植前一周于移植部位制造新创面,炎症可刺激新生血管形成,随后在创面处进行皮质片移植,缩短移植后血管生成时间,减少缺血损伤。⑤ 间充质干细胞有促进血管生成、分泌生长因子和多谱系分化的能力。Cho等[27]研究发现,向卵巢损伤的大鼠体内注射间充质干细胞,与新鲜对照组相比,抗苗勒管激素(anti-Müllerian hormone,AMH)、卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone,FSH)和雌二醇 (estradiol,E2) 水平显著升高(P<0.05),说明间充质干细胞能够恢复受损卵巢的内分泌功能,通过激活PI3K/AKT/mTOR信号通路,促进移植后血管生成和卵泡发育。⑥ 促性腺激素,如Mueller等[28]研究发现, FSH可上调VEGF、bFGF和FSH受体相关基因及蛋白表达,改善移植后的卵巢血运。⑦ 处理组织时保留部分髓质,Mueller等[28]研究发现,与单独移植牛卵巢皮质组相比,含有髓质的皮质组在冷冻和解冻后都保留了较高的组织形态,且移植后新生血管增加,卵泡存活率增加。

综上所述,未来在人卵巢组织移植时可以考虑添加促血管生成因子、促性腺激素、S1P、Z-VAD-FMK等物质,或适当保留髓质,或诱发炎症反应等方法促进血管生成,以期改善移植结局。

2.3 氧化应激

缺血再灌注损伤发生在移植部位的血运重建之前,是造成卵泡丢失的重要因素之一。在冷冻和移植后加入抗氧化剂能减少氧化应激反应。常见抗氧化剂有维生素C、维生素E、谷胱甘肽、褪黑素及辅酶Q10等。N-乙酰半胱氨酸为半胱氨酸前体,可合成谷胱甘肽。Olesen等[29]将人卵巢组织异种移植到小鼠体内,在移植后给予150 mg/kg的N-乙酰半胱氨酸7 d,发现抗氧化标志物、抗凋亡因子及血管生成因子的相关基因表达增加,氧化应激反应减轻。褪黑素作为自由基清除剂,被证明在移植早期可提高卵泡存活率和减少缺血性损伤,移植后期增加卵巢皮质大小[30]。

2.4 临床因素

移植后卵巢组织的寿命和功能还与一些临床因素相关,如患者年龄、有无接受过性腺毒性治疗以及移植碎片的数量。爱丁堡标准将卵巢组织冻存年龄限定为35岁,该群体女性移植后妊娠率为33%,超过35岁妊娠率仅为18%[31]。卵巢冻存前的放化疗可导致卵巢皮质纤维化和血管损伤,影响移植后血管生成。因此,在移植前后需要综合考虑患者的基本情况,制定合理的个性化方案,尽量减少因年龄、放化疗后等因素对卵巢造成的额外损伤。

3 组织运输

冷冻和移植是生育力保存过程中的主要影响因素,除此之外,在卵巢组织摘取之后的运输及冷冻后的复苏过程也是其不可忽略的一部分。

3.1 运输温度

静态低温保存(static cold storage,SCS)是目前常用的卵巢运输和保存的方法,其原理是将组织转移至4～8℃的低温环境中,利用低温分解代谢酶、减缓细胞新陈代谢及减少氧化应激反应[32]。温度与代谢率呈现一定相关性,在0～4℃时细胞代谢率降低90%甚至更多[33]。2018年由德国-奥地利-瑞士组成的FertiPROTEKT医学团体认为4℃是卵巢组织转运的最适温度[34]。目前有关人卵巢组织运输温度的研究有限,温度主要在4～37℃之间变化。

3.2 运输时间

在玻璃化冷冻前,未经渗透脱水的卵巢组织置于运输保存液时间过久会因组织缺血缺氧造成细胞质、细胞膜、内质网和溶酶体等不可逆性损伤,诱导卵泡凋亡[35]。24 h内的卵巢低温转运是目前大多数临床上采取的标准。而Isachenko等[36]验证了在4℃下低温运送人卵巢组织26 h的可行性,卵泡雌激素水平与对照组相似(375 pg/mL vs 336 pg/mL)。目前,多数生殖中心冷冻及移植的成功率表明,低温下卵巢组织运输是一个可行方案,但是需要更多的实验和数据验证人卵巢组织超过26 h转运的有效性。当前临床工作者应尽可能节省运输时间以防止潜在损害。

4 组织复苏

组织复苏是移植前的关键一步,组织在复苏后要尽快移至体内,临床工作中常会在移植部位确定后再启动复苏程序,移植手术和复苏时间需要相互协调,因此,选择合适的复苏程序和时间至关重要。Perdrix等[37]比较了缓慢及快速两种复苏方案,缓慢复苏即将卵巢皮质在30℃水浴中预热,再依次放入浓度递减的CPAs中洗涤;而快速复苏是将皮质在37℃水浴中预热,再放入仅有Leibovitz L15培养基中洗涤2次,研究显示缓慢组和快速组卵泡的形态正常率分别为97.5%和82.7%,可见CPAs浓度递减的缓慢复苏方案更适合卵巢后期移植。由于冷冻保护剂成分的多样性,不同的解冻过程之间毫无可比性。金凤羽等[38]将冷冻复苏后的人卵巢组织分别在体外培养0 min、20 min、40 min、60 min,与新鲜组相比,复苏后不同的时间点卵泡数和雌激素水平比较,差异无统计学意义。因此,临床工作者可以考虑移植手术与复苏程序同时启动,严格等待移植部位确定再复苏可能是不必要的。

5 总结与展望

卵巢组织冷冻保存是生育力保存的重要方法之一,是青春期前女性及迫切需要进行放化疗的育龄期恶性肿瘤患者的唯一选择。但该项技术从实验室走向临床仅仅数十年,仍需深入研究生育力保存过程中的影响因素。本文从4个方面阐述了影响卵巢皮质运输、冷冻、复苏及移植的可能因素,由于目前仍无统一的组织保存及移植标准,且多数研究仅限于试验验证阶段,生育力保存依然任重而道远,未来应该致力于提高卵泡安全性,根据患者的具体情况,制定合理的个性化方案。