重庆部分地区山羊场蓝舌病流行情况调查

张邑帆，郑 华，张素辉

（重庆市畜牧科学院，重庆市兽用生物制品工程技术研究中心，国家动物疫病重庆观测实验站，重庆 荣昌 402460）

羊蓝舌病是一种病毒性疾病，是由蓝舌病病毒（BTV）感染造成的，因患病羊的舌头呈蓝紫色而被命名为羊蓝舌病。患病动物的血液和精液中均含有大量病毒［1］，可以通过吸血昆虫传播病原［2］。由于精液中含有大量病毒，可以在公母羊交配时将疾病传播给对方。对于妊娠期的母羊，该病极易造成流产与死胎。蓝舌病毒的血清型有多种，疫苗免疫非常困难，免疫效果不理想，但是科学化饲养管理可以有效降低蓝舌病的患病率。

国家动物疫病重庆观测实验站于2021 年3月～2023 年6 月对重庆市6 个区县的35 个山羊场进行全血样品采集，应用RT-nested PCR 方法进行BTV检测，分析各区县羊群的BTV感染情况及流行特点，为防控该病提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 样品 1 771份山羊全血样品分别于2021年3月～2023年6月采集自重庆荣昌、石柱、彭水、酉阳、长寿和武隆共6个区县的35个山羊场，每半年采集一次，故2023年下半年的样品未采集。

1.2 主要试剂 病毒DNA/RNA 提取试剂盒，购自西安天隆科技有限公司；DL2000 DNA Marker，2×Taq PCR MasterMix，购自宝生物工程（大连）有限公司；反转录试剂：HiScript II One Step RT-PCR 试剂盒购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 引物设计与合成 根据GenBank 发表的BTV及相关病毒的基因序列，目的基因片段大小为100 bp，引物序列为：BTV-A：5′-GTTCTCTAGT TGGCAACCACC-3′；BTV-B：5′-AAGCCAGACTG TTTCCCGAT-3′；BTV-C：5′-GCAGCATTTTGAGA GAGGGA-3′；BTV-D：5′-CCCGATCATACATTGC TTCCT-3′。引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.3.2 RNA 提取 本试验使用全自动核酸提取仪进行RNA 提取，按照试剂盒要求在试剂盒加样孔内加入200 μL羊血样品、20 μL蛋白酶K，在磁珠孔插入搅拌套后放入全自动核酸提取仪内进行RNA 提取。等操作完成后，用移液器移出50 μL RNA模板到1.5 mL离心管内备用。

1.3.3 RT-PCR 扩增 反应体系（20 μL）：上述提取的RNA 模板5 μL，BTV-A、B 引物各0.5 μL，2×One Step Mix 10 μL，One Step Enzyme Mix 1μL，ddH2O 3μL。反应条件：50 ℃反转录30 min；95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，共40次循环；72 ℃延伸10 min。

1.3.4 PCR扩增 反应体系（25 μL）：上述扩增的RT-RCR产物模板1 μL，BTV-C、D引物各0.5 μL，2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL，ddH2O 10.5 μL。反应条件：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s、51 ℃退火30 s、72 ℃延伸20 s，共30 次循环；72 ℃延伸10 min。PCR 扩增产物经2.5%琼脂糖凝胶电泳检测，电泳缓冲液为1×TAE，电泳条件为110 V 30 min，凝胶成像系统拍照保存，阳性对照片段大小为100 bp。

2 结果

2.1 不同区县BTV检测结果 2021～2023年对重庆6个区县35个山羊场的1 771份山羊全血样品进行BTV 检测，结果得出：总样品阳性率为6.2%（109/1 771），场阳性率为42.9%（15/35）；荣昌的样品阳性率为9.6%（29/303），石柱的样品阳性率为3.8%（13/344），彭水的样品阳性率为2.9%（9/310），酉阳的样品阳性率为11.1%（36/325），长寿的样品阳性率为6.5%（20/306），武隆的样品阳性率为1.1%（2/183）。详见表1。

表1 重庆部分区县的BTV检测结果

2.2 2021～2023年BTV检测结果 由表2可知，2021年样品阳性率为4.9%（31/631），2022年样品阳性率为8.6%（66/766），2023 年样品阳性率为3.2%（12/374）。

表2 2021～2023年BTV检测结果

2.3 某山羊场BTV检测电泳图 由图1可知，待检测的22 个样品中，有7 个样品的BTV 为阳性（编号：2、3、4、12、14、15、17）。

图1 某山羊场BTV检测电泳图

3 讨论

羊蓝舌病主要是BTV 引起的一种严重侵害反刍动物的传染病，主要由吸血昆虫传播。羊蓝舌病会造成母羊流产，严重的会引起吞咽困难和呼吸困难，部分羊还会出现便秘或者腹泻。

由于公羊的精液和妊娠母羊的胎盘都能造成垂直传播，引起羔羊患病，因此，每一头羊都要给予严格的检查，对患病羊需要及时淘汰，严重者可及时扑杀，防止造成更多健康羊感染。在夏季，圈舍需要做灭蝇灭虫处理。

重庆酉阳土家族苗族自治县和荣昌区感染BTV 的阳性率最高，分别为11.1%和9.6%。荣昌和酉阳相比，荣昌的场阳性率为25%（2/8），酉阳的场阳性率为75%（3/4），荣昌有2个场的感染相当严重。经过调查，发现这两个区县的几个山羊场有两个共同点：一是从其他地区引进山羊进行品种改良，可能将病毒不小心带入健康羊舍；二是没有对感染山羊进行及时淘汰，只进行了隔离，故阳性率偏高。BTV样品阳性率最低的是武隆区，为1.1%（2/183），分析原因如下：一是科学的饲养管理，夏季圈舍的灭蝇灭虫工作做得好；二是武隆区的样品数偏低。

目前，对BTV流行情况的调查基本上只针对抗体，而没有对抗原的调查。有文献报道内蒙古的BTV 阳性率为4.17%［3］，新疆的BTV 阳性率为6.79%［4］，广西的BTV 阳性率为20.5%［5］。受时间和人力的限制，此次调查选择的区县较少，可能与全重庆市的实际情况存在一定差异。今后，我们会持续开展BTV感染情况调查，掌握BTV在重庆地区的流行趋势，为重庆地区BTV的防控工作提供科学依据。

4 结论

本研究调查了重庆市6 个区县的35 个山羊场，共采集1 771 份山羊全血样品，通过检测，得出BTV样品总阳性率为6.2%（109/1 771），总体水平偏低。