细菌挂膜结合鱼蚌混养对养殖水体水质的原位调控模拟

薛 琼,梁文伯,耿 冰,汪雅文,宋海亮,杨小丽,*

(1.南京市生态环境保护科学研究院,江苏南京 210013;2.东南大学土木工程学院,江苏南京 211189;3.上海城市水资源开发利用国家工程中心有限公司,上海 200082;4.南京师范大学环境学院,江苏南京 210023)

除此之外,在养殖水体中,适当投入硝化细菌制剂,可将对水产品有毒害作用的氨态氮和亚硝酸盐转化为无毒的硝酸盐[14],从而改善养殖水体水质,减少其对鱼类的危害[15]。直接利用游离态的微生物有较多缺点,如对抗水体冲击能力弱、对温度等环境因子变化敏感等。如果在养殖水体中投入填料,经过一定时间的培养,投放的微生物可在填料表面形成一层稳定性较高的生物膜[16],对外界的干扰具有较强的抵抗力,可以强化对养殖水体的净化作用[17-19]。目前碳纤维与毛毡是比较常用的水体净化填料。

鱼蚌混养与微生物膜技术对于养殖水体的调控已有一定的研究,但将两种技术结合来调控养殖水体的研究还比较少。因此,本文从改变养殖方式及添加挂膜微生物两方面来调控养殖水体,探究原位修复养殖水体的新方法,并探究该体系对水产品品质的影响,以期同时提高生态效益和经济效益。

1 材料与方法

1.1 试验材料及试验养殖系统的构建

本试验设置室内模拟试验,试验容器为150 L白色塑料圆筒,每只桶内投入养鱼7个月后自然形成的养殖水,水量为128 L,初始水质如表1所示。草鱼(Ctenopharyngodonidellus)、鲫鱼(Carassiusauratus)、鲢鱼(Hypophthalmichthysmolitrix)与鳙鱼(Aristichthysnobilis)4种鱼类购于四川运龙水产养殖场,三角帆蚌(Hyriopsiscumingii)购于湖南小明水产养殖场。

表1 养殖水初始水质Tab.1 Initial Water Quality of Aquaculture Water

试验用饲料购于通威股份有限公司的通威180(浮料)和通威126(沉底料),两种饲料各种营养成分指标如表2所示。硝化细菌购于德丰生物技术公司,有效活菌数为2×108g-1。

表2 饲料营养成分指标Tab.2 Indices of Feed Nutrient Contents

1.2 试验设计

本试验共设置3组试验,3组试验的装置如图1所示。

图1 试验系统示意图Fig.1 Schematic Diagram of Experiments

1.2.1 鱼蚌混养系统优化试验

试验1考察三角帆蚌密度对鱼类混养体系的水质及混养鱼类产品品质影响,根据水质及水产品品质变化,确定最佳鱼蚌放养比例。试验1设计如图1(a)所示,共设3个处理,分别是:2∶1M,草鱼+鲫鱼+鲢鱼+鳙鱼混养三角帆蚌,鱼蚌数量比为2∶1;3∶1M,草鱼+鲫鱼+鲢鱼+鳙鱼混养三角帆蚌,鱼蚌数量比为3∶1;4∶1M,草鱼+鲫鱼+鲢鱼+鳙鱼混养三角帆蚌,鱼蚌数量比为4∶1。根据Tang等[11]的研究,将混养鱼“草鱼-鲫鱼-鲢鱼-鳙鱼”的数量比固定为6∶2∶1∶1。三角帆蚌用网笼吊养在塑料桶中,每个网笼中放养一个三角帆蚌,吊养于水面下30 cm。试验开始时三角帆蚌、混养鱼的放养量如表3所示。每天9:00和17:00时2次向混养鱼类投喂混养鱼类饲料。系统中的草鱼和鲫鱼投喂通威126,系统中的鲢鱼和鳙鱼投喂通威180,投饲量为鱼体重的4%。试验期间24 h曝气,曝气流量设定为50 L/h。3个处理各设置3组重复。

表3 混养体系优化试验鱼蚌放养数量Tab.3 Amount of Fishes and Mussels in Optimized Experiment of Polyculture System

1.2.2 填料筛选试验

生物膜的形成与生物载体有关,试验2为毛毡和碳纤维对象展开研究,通过对挂膜启动及稳定运行两个阶段的情况进行综合分析,选择出一种养殖水体净化能力最强的载体,并将其运用到实际养殖系统中。试验2设计如图1(b)所示,共设毛毡组和碳纤维组两个试验组。将尼龙绳系于塑料桶两端,5条1 m长的碳纤维和毛毡填料等距挂在绳子上,垂直挂入水中,使填料在水中处于散开状态,其中碳纤维组合填料片的间距为10 cm。按照1 m3投放300 g菌剂的比例添加硝化细菌。试验期间24 h曝气,曝气流量设定为50 L/h。两个处理间各设置3组重复。

1.2.3 填料密度对于鱼蚌混养的水质与水产品品质的影响

根据前人研究发现,当填料密度过低时,由于挂膜细菌数量少,造成填料对水体的净化能力差;而填料密度过高时,过量的挂膜细菌又会过量利用氮、磷,降低鱼类对于氮、磷的利用率。因此,本试验以1.2.1小节的结果构建混养系统,将1.2.2小节中挑选出的填料,设置不同密度投入鱼蚌混养系统,根据后续试验中养殖水体水质指标和水产品生长、品质指标确定最佳填料密度。

试验3共设4个试验组。CK:三角帆蚌与4种鱼混养,不投放填料。T-5:三角帆蚌混养草鱼+鲫鱼+鲢鱼+鳙鱼,投放5组填料。T-10:三角帆蚌混养草鱼+鲫鱼+鲢鱼+鳙鱼,投放10组填料。T-15:三角帆蚌混养草鱼+鲫鱼+鲢鱼+鳙鱼,投放15组填料。4个试验组中均不额外投加硝化细菌制剂,每个试验组的投饲量为鱼体重的4%。系统如图1(c)所示。试验期间24 h曝气,曝气流量设定为50 L/h。3个处理间各设置3组重复。

1.3 养殖水体水质测定

1.4 水产品品质测定

试验结束后,将样品用样品袋分类保存于-80 ℃冰箱中,进行鱼类样品品质化学分析。对鱼样进行水分、灰分、蛋白质和粗脂肪测定,水分采用105 ℃干燥法测定,灰分采用马弗炉550 ℃灼烧法测定,粗蛋白采用凯氏定氮法测定,粗脂肪采用索氏抽提法测定[20-23]。

1.5 数据计算

水产品存活率与生长率计算如式(1)～式(3)。

SR=100×Nt/N0

(1)

GL=100×[(Lt-L0)/L0]/T

(2)

GW=100×[(Wt-W0)/W0]/T

(3)

其中:SR——淡水鱼类与三角帆蚌存活率;

Nt——试验结束时鱼类的数量;

N0——试验开始时鱼类的数量;

GL——每日壳长/体长生长率;

Wt——试验结束时放养鱼类体重,g;

W0——试验开始时放养鱼类体重,g;

GW——每日蚌重/体重生长率;

Lt——试验结束时放养鱼体长,cm;

L0——试验开始时放养鱼体长,cm;

T——运行天数,d。

模拟养殖塘氮、磷收支平衡计算如式(4)～式(7)。

MN,P=MN,P’+O

(4)

MN,P=M鱼+M蚌+C饵×M饵

(5)

MN,P’=M鱼’+M蚌’+M水

(6)

M水=C水×Q

(7)

其中:MN,P——输入物中氮、磷质量,g;

MN,P’——输出物中氮、磷质量,g;

O——输入与输出TN、TP质量之差,g;

M鱼——养殖开始前混养鱼类中氮、磷质量,g;

M蚌——养殖开始前三角帆蚌中氮、磷质量,g;

C饵——各饵料氮、磷质量分数;

M饵——养殖过程中投入的各饵料质量,g;

M鱼’——养殖结束后混养鱼类中氮、磷质量,g;

M蚌’——养殖结束后三角帆蚌中氮、磷质量,g;

M水——养殖结束后水体中的氮、磷质量,g;

C水——养殖结束后水体中的氮、磷质量浓度,mg/L;

Q——养殖水量,L;

模拟养殖塘内氮、磷输出途径主要有渔获、养殖水体及其他因素(渗漏+蒸发+网片转化和吸附等),其中“O”为输入与输出TN、TP之差[24],单位为g。

1.6 挂膜微生物群落测定

在试验完成后,取出填料,参照蒋青青[25]的方法,选择所要提取的生物膜部位,使用PBS溶液轻柔地漂洗除去残余物质,使用干净的刀片/剪刀取样品放入试剂盒所带的研磨小管中,交由广州基迪奥生物科技有限公司完成高通量测序,解析微生物群落结构。

1.7 统计学分析

利用Excel、Origin 2018进行数据整理及作图,统计结果均以平均值±标准差表示,用SPSS 22.0进行统计分析。多重比较用Duncan′s test进行,取P<0.05为差异显著性水平。

2 结果与分析

2.1 鱼蚌混养体系模式优化

根据Tang等[11]的研究,在80 d后打捞鱼类,对水产品品质等数据进行检测。在本部分试验中,养殖水质的pH与DO均满足《渔业水质标准》(GB 11607—1989)。除了4∶1M试验组中草鱼和鳙鱼存活率为75%,其余组别混养鱼的存活率均为100%。试验中混养鱼类体长与体重的生长如表4所示,试验组2∶1M、3∶1M体长生长率显著高于4∶1M(P<0.05),4∶1M的体长生长率最低,仅为0.117%±0.001% d-1。试验组2∶1M体重生长率显著高于3∶1M和4∶1M(P<0.05),为0.459%±0.004% d-1;4∶1M的体重增长率最低,为0.408%±0.006% d-1。

表4 试验1中鱼类体长和体重的生长Tab.4 Changes in Body Length and Weight of Fishes in Experiment 1

根据表5可知,在水分含量比较中,草鱼、鲫鱼与鳙鱼在鱼蚌比为2∶1时,水分含量显著低于其他两个试验组(P<0.05),而鲢鱼的水分含量在3组间没有显著差别(P>0.05)。针对草鱼与鲫鱼的灰分测量结果可知,3组试验组间没有显著差异(P>0.05),但是2∶1M组中测得的灰分最低,鲢鱼与鳙鱼的灰分含量在2∶1M组显著低于3∶1M和4∶1M两个试验组(P<0.05)。针对蛋白质的测量结果与灰分类似,3组试验中草鱼与鲫鱼的蛋白质含量并无显著差异,但在2∶1M试验组中,草鱼与鲫鱼测得的蛋白质含量较高;鲢鱼与鳙鱼的蛋白质含量在2∶1M中显著高于其余两组试验组。4种鱼的粗脂肪含量在2∶1M组中均显著高于其他组别(P<0.05)。

表5 试验1中鱼类品质的测定Tab.5 Fish Quality Determination in Experiment 1

2.2 填料种类筛选

一般认为装置内挂膜材料上有一层薄膜覆盖,且氨氮去除率在60%左右时,即为挂膜成功[26]。根据试验数据计算,碳纤维试验组在装置运行5 d时,氨氮去除率为62.35%,挂膜成功;毛毡试验组在装置运行9 d时,氨氮去除率为62.79%,挂膜成功。

图2 不同填料体系内各种水质指标的变化Fig.2 Changes of Water Quality Indices in Different Packing Systems

注:不同小写字母表示不同试验组间各水质指标的差异达显著水平(P<0.05)。

由试验结果可知,碳纤维填料成膜速度快,且对养殖水体的净化效果要优于毛毡,因此,选取碳纤维作为试验对象,优化该填料的投放密度,在调节养殖水体水质的同时,保证水产品品质。

2.3 不同填料填充率对于养殖水体水质与水产品品质的影响

2.3.1 对养殖水水质的影响

注:不同小写字母表示不同试验组间各水质指标的差异达显著水平(P<0.05)。

2.3.2 对水产品品质的影响

试验中混养鱼类的存活率如表6所示。CK组的草鱼和鲢鱼存活率最低,分别是75%和80%;T-15试验组草鱼和鲫鱼的存活率最低,为80%;而T-10试验组中4种鱼类的存活率最高,均为100%。

表6 试验中混养鱼类的存活率Tab.6 Survival Rates of Polyculture Fishes

试验中混养鱼的体长和体重生长率如表7所示。空白和T-10试验组的体长生长率显著高于其他处理组(P<0.05),T-10试验组体长生长率最高,为0.416%±0.040%,T-15试验组的体长生长率最低,为0.244%±0.083%。T-10试验组的体重生长率显著高于其他处理组(P<0.05),为0.462%±0.005%,T-5试验组的体重生长率最低,为0.382%±0.005%。

表7 试验3中混养鱼的体长和体重生长率Tab.7 Changes in Body Length and Weight of Fishes in Experiment 3

由表8可知,CK组4种鱼的水分含量偏高,且显著高于其他试验组(P<0.05),T-5、T-10和T-15试验组间水分含量无显著差异(P>0.05)。在灰分比较中4种鱼的各试验组间灰分含量均无显著差异。在蛋白质含量比较中,4组试验组的蛋白质含量均高于鸡蛋蛋白[28],且T-10试验组内4种鱼的蛋白质含量均显著高于其他试验组(P<0.05)。针对粗脂肪这一指标而言,T-5试验组中草鱼与鲫鱼的粗脂肪含量显著高于其他试验组内的草鱼与鲫鱼的粗脂肪含量(P<0.05),而T-10试验组中鳙鱼的粗脂肪含量显著高于其他试验组(P<0.05),根据脂肪含量进行分类,这4类鱼均属于中脂类鱼[29]。因此,T-10试验组养殖出的鱼类满足“高蛋白、中脂”的健康营养需求[30-31]。

表8 试验3鱼类品质Tab.8 Fish Quality in Experiment 3

2.4 挂膜微生物群落分析

分析T-5、T-10与T-15 3组在门和属上的物种丰度分布,来研究不同数量的碳纤维生物膜的微生物群落结构。本试验过程中3个试验组在门分类水平上的菌群丰度如图5所示。在这些细菌中,变形菌门(Proteobacteria)所含的丰度最高,在处理组T-5、T-10和T-15中的占比分别为48.65%、53.9%和39.78%。在处理组T-5的物种丰度分布中,绿湾菌门(Chloroflexi)和拟杆菌门(Bacteroidetes)仅次于变形菌门,占比分别为17.21%和10.78%。在处理组T-10的物种丰度分布中,厚壁菌门(Firmicutes)仅次于变形菌门,占比为13.86%。在处理组T-15的物种丰度分布中,厚壁菌门和拟杆菌门仅次于变形菌门,占比分别为10.98%和14.86%。除此以外,在3组处理组中均发现了少量的疣微菌门(Verrucomicrobia)、酸杆菌门(Acidobacteria)。变形菌门为3组处理组中碳纤维微生物群落中的主要菌门。

图5 挂膜微生物在门水平物种分布Fig.5 Microbial Community Structure at the Phylum Level

本试验过程中3组试验组在属分类水平上的菌群丰度如图6所示。在3组处理组碳纤维的物种丰度分布中,T-10中梭状芽孢杆菌-1(Clostridiumsensustricto1)占比最高,为7.16%。除此以外,Denitratisoma在3组处理组中都有一定的比例。梭状芽孢杆菌-1为碳纤维微生物群落中的主要菌属。

图6 挂膜微生物在属水平物种分布Fig.6 Microbial Community Structure at the Genus Level

2.5 氮、磷归趋分析

T-10试验组各养殖品种和饵料的氮、磷含量如表9所示。氮、磷物料平衡计算结果如图7所示。

图7 混养鱼池塘氮、磷收支Fig.7 Nitrogen and Phosphorus Incoming and Outcoming in Polyculture Ponds

表9 各养殖品种和饵料的氮、磷含量Tab.9 Nitrogen and Phosphorus Content of Each Breed and Bait

整个养殖过程的氮收支平衡方程为:混养鱼类与三角帆蚌苗种(26.7 g)+饲料(242.72 g)=混养鱼类与三角帆蚌的渔获物(56.83 g)+养殖水体(155.88 g)+其他(56.71 g)。磷收支方程为:混养鱼类与三角帆蚌苗种(18.84 g)+饲料(75.86 g)=混养鱼类与三角帆蚌的渔获物(24.07 g)+养殖水体(62.88 g)+其他(7.75 g)。

3 讨论

3.1 鱼蚌混养体系模式优化

在鱼蚌混养体系模式优化研究中,混养鱼的养殖密度随着鱼蚌比的增加而增大。研究表明,鱼类养殖中的养殖密度是影响鱼类生长、饵料利用及鱼产量的重要因素[30-31],过大的养殖密度会挤压鱼类的生活空间,导致存活率低,水产品品质变差。由试验结果可知,鱼蚌比为2∶1时,混养鱼的生长率最高,且蛋白质、粗脂肪含量较高,混养鱼品质较优。

3.2 填料填充率对于水产品与养殖水体的影响

分析试验结果,在试验3中,CK组氮、磷浓度维持在较高水平;而挂膜试验组,即T-5、T-10与T-15试验组中,能使养殖水体中氮、磷水平降低,其中T-10和T-15试验组各水质指标改善效果明显优于T-5试验组。由此可知,增加填料密度可以有效增加细菌附着面积,改善养殖水体水质。对比T-10与T-15试验组,其对于养殖水体水质的处理能力基本相同,分析原因可能是碳纤维密度过高,使微生物生长代谢所需营养相对缺乏,导致T-15试验组微生物代谢受阻。Moussavi等[32]将聚氨酯海绵作为填料加入循环旋转床反应器系统中,研究填充率为0～40%的模拟废水的净化效果,发现填充率为30%时净化效果最佳。王帆等[33]的研究也发现,当填料填充率为30.5%、36.6%时,对于模拟城市污水的净化效果、膜生物量以及生物活性均相差甚微。结合本研究结果可以得出,在养殖水体净化中采用生物技术时,填料投加密度十分重要,要在有效去除氮、磷的基础上控制成本,避免不必要的浪费。

与此同时,由于水质的改善,直接提高了水产品的存活率与品质。T-10试验组水产品的存活率、生长率与品质均优于T-15试验组,分析原因是碳纤维密度过高使微生物生长代谢所需营养处于匮乏状态,与水产品形成营养竞争关系,且在空间上压缩了鱼类的生活空间,使水产品生长受到限制,从而影响鱼类生存与生长。由此得出,虽然碳纤维填料密度较高时,各项水质指标均可维持在较优水平,但在实际应用时,还要根据实际养殖面积确定合适的碳纤维密度,以免影响水产品的生存与生长。这一结果与殷记强等[34]的研究一致。

3.3 养殖模式对养殖水体原位调控的效果分析

根据试验3中的水质结果,相比生态浮岛-碳纤维原位修复技术,细菌挂膜+鱼蚌混养技术更好地对养殖水体进行调控[35],可能是由于试验3体系中添加三角帆蚌,形成多营养层次综合养殖体系[36],有利于提高投入饲料营养物质利用率,降低污染物产生。而相比有关研究报道,鱼蚌共养体系的水质指标均略高于鲻虾共养体系[37],推测是由于相比三角帆蚌,鲻对营养物质的需求量更高,可以更快速地消耗对虾养殖产生的沉积物,减少体系中的污染物浓度。

3.4 微生物群落分析

由微生物群落结构数据可知,试验结束后,T-15处理组中厚壁菌门相对丰度较低,这类细菌可以反映水体受污染程度,推测是因为随着试验的进行,氮、磷含量下降,污染得到削减之后,水质得到一定程度改善,使微生物群落结构产生影响,这与翟一帆等[38]对养猪废水处理系统微生物群落结构的分析结果一致。变形菌门与脱氮性能有关,试验结束后T-10和T-15试验组变形菌门相对丰度较高,主要是因为增加碳纤维填料投放密度可以增大其丰度[39-40]。研究[41-42]证明,绿弯菌门(Chloroflexi)能在不同营养程度的环境中生存,但富营养化程度高的区域绿弯菌门更丰富,表明其更倾向生活在营养充足的环境中。根据图4可知,在体系稳定后,T-5处理组氮、磷浓度高于T-10与T-15试验组,使这类细菌在T-5试验组具有明显的生存优势。

3.5 氮、磷归趋方程分析

由氮、磷归趋分析可知,饲料是池塘主要的氮、磷来源,其所含氮、磷占总输入氮、磷的90.1%和80.1%[43]。渔获物所含氮、磷占池塘TN、磷输出的21.1%和25.4%。结合前人的研究,淡水鱼对于氮的利用率约为18.0%～37.9%[44-46],本研究中的4种鱼类与三角帆蚌的氮利用率均在此范围之内;本试验中水产品对于磷的利用率略高于相关研究[47-48],推测是由于本研究饵料中的磷占TP的比例略低,对于水产品的供给量不足,从而提高了水产品对于磷的利用率。

4 结论

(1)通过鱼蚌混养体系优化试验可以得出,最佳混养鱼组合为三角帆蚌与“草鱼-鲫鱼-鲢鱼-鳙鱼”混养,最佳鱼蚌比为2∶1,即20条鱼搭配10个蚌。

(2)相比毛毯填料,添加了碳纤维填料的试验组细菌挂膜速度较快,在试验结束时,碳纤维填料试验组的水质明显好于毛毡试验组。

(3)填料密度筛选试验结果表明,在模拟养殖水体中添加10条1 m的碳纤维填料,可以在鱼蚌比为2∶1的鱼蚌混养体系中显著降低养殖水体中的氮、磷含量,进而实现对养殖水体的原位调控,同时还可以获得较高的水产品品质,实现生态效益与经济效益的双赢。