红火蚁告警信息素2-乙基-3,6-二甲基吡嗪在天然橡胶塞和PVC管载体中的释放规律及田间验证

丁浩毅, 黄 俊, 张 娟, 李晓维, 张大羽, 吕要斌1,,*

(1. 浙江农林大学现代农学院, 杭州 311300; 2. 浙江省农业科学院植物保护与微生物研究所,农产品质量安全危害因子与风险防控国家重点实验室, 农业农村部和浙江省植保生物技术重点实验室,杭州 310021;3. 浙江省农业科学院园林植物与花卉研究所, 杭州 311122)

红火蚁Solenopsisinvicta是隶属膜翅目(Hymenoptera)蚁科(Formicidae)火蚁属Solenopsis的一种典型的农林业害虫,原产于南美洲(Lofgrenetal., 1975)。自2004年在中国广东省吴川市发现红火蚁入侵以来,目前已在我国12个省区市的534个县(市、区)都有发生,较2001年疫情发生县级行政区增加128个。红火蚁不仅取食作物造成减产,还叮咬甚至杀死家畜(Leietal., 2021),也会在电路设施中筑巢并破坏电力设施(Vander Meeretal., 2008);红火蚁还会通过蜇咬引起人的过敏反应甚至休克、死亡(Vargo and Hulsey, 2000),破坏入侵地生态系统,减少其他生物种群数量(Valles and Porter, 2013; 陆永跃等, 2019)。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1红火蚁告警信息素:红火蚁告警信息素2-乙基-3,6-二甲基吡嗪由作者所在实验室根据Wolff-Kishner-黄鸣龙还原法合成(王丽坤等, 2021),纯度≥97%。

1.1.2缓释载体:选择两种目前在实际生产中广泛应用的诱芯载体。一种是绿色NRP(北京中捷四方生物科技股份有限公司生产),长度为1.5 cm,直径为1.0 cm;另一种为PVCP(杨凌翔林农业生物科技有限公司生产),为一端开口另一端封口设计,主要材质为聚氯乙烯,长度为8.0 cm,外径为1.2 mm,壁厚度为0.25 mm。诱芯载体在使用前,采用正己烷浸泡24 h,于75 ℃烘箱中烘干2 h,待其中的正己烷挥发完全后,将诱芯载体分装到玻璃瓶中密封备用。

1.2 标准曲线制作

利用乙腈将2-乙基-3,6-二甲基吡嗪稀释为10, 50和100 ng/μL 3种浓度的溶液,分别取3种浓度的溶液各1 μL注射到气相色谱-质谱联用仪(GC-MS, Agilent 7890B-5977B)中,测定总离子流图中2-乙基-3,6-二甲基吡嗪的峰面积,并制定其剂量与峰面积的标准曲线。

GC-MS工作条件:色谱柱HP-5MS,长30 m×内径250 μm×膜厚0.25 μm;无分流进样;程序升温:初始温度40 ℃,以10 ℃/min升到80 ℃后保留1 min,以10 ℃/min升到120 ℃后保留1 min,以10 ℃/min升到150 ℃后保留1 min,以10 ℃/min升到200 ℃后保留2 min,以10 ℃/min升到250 ℃后保留2 min;进样口温度为200 ℃;载气为He(>99.999%);离子源EI,离子源温度230 ℃;四级杆温度150 ℃;电子能量70 eV;扫描质量范围50～450 amu。

1.3 红火蚁告警信息素在不同载体中的释放量测定

应用顶空固相微萃取(headspace solid-phase microextraction, HS-SPME)和气相色谱-质谱联用(gas chromatogram-mass spectrometry, GC-MS)技术测定2-乙基-3,6-二甲基吡嗪在两种缓释载体NRP和PVCP中的释放规律。用乙腈将2-乙基-3,6-二甲基吡嗪分别稀释成10 000, 1 000和100 ng/μL的溶液,取10 μL分别单独加入两种缓释载体中,在温度(25±1) ℃、相对湿度60%±5%的室内环境中分别萃取15, 30和60 min,之后测定SPME萃取头(100 μm,Polydimethylsiloxane Coating,Supelco公司)萃取2-乙基-3,6-二甲基吡嗪的释放量。萃取前先将SPME探针插入到气相色谱仪的进样口中(孙洁雯等, 2015),在200 ℃条件下老化1 h,以去除萃取头上残留的杂质。萃取时,首先将加样后的载体放入40 mL的棕色样品瓶中,盖上盖子并旋紧密封,随后将SPME探针针管刺穿样品瓶盖上的胶垫进入到棕色样品瓶中以吸附载体释放的红火蚁告警信息素。每个浓度和每个萃取时间的2种载体均设3次重复。之后,将SPME探针针管插入气象色谱仪的进样口,推动手柄杆,伸出探针萃取头,热脱附分析物5 min,使其进入色谱柱。通过气相色谱-质谱联用仪对载体释放后SPME萃取头上吸附的红火蚁告警信息素的量进行测定。基于GC-MS得到的峰面积图进行自动积分,得到对应的色谱峰面积数值。根据1.2节中绘制的红火蚁告警信息素剂量与峰面积的标准曲线,由峰面积计算出2-乙基-3,6-二甲基吡嗪在不同剂量、不同萃取时间下在NRP和PVCP两种载体中的实际释放量。

1.4 红火蚁告警信息素在不同载体中的释放速率

根据1.3节中计算得出的红火蚁告警信息素2-乙基-3,6-二甲基吡嗪在不同剂量、不同萃取时间下NRP和PVCP两种载体中的实际释放量(ng),计算得到2-乙基-3,6-二甲基吡嗪在NRP和PVCP两种载体中的释放速率(ng/h)。

1.5 田间验证

根据1.4节中测定的2-乙基-3,6-二甲基吡嗪在NRP和PVCP中的释放速率,选取相应浓度的2-乙基-3,6-二甲基吡嗪各10 μL分别溶于两种载体,将载体粘于红火蚁诱集器底部,配合红火蚁监测诱饵使用。

进行田间试验时,选取特定蚁巢,将组合好的红火蚁诱集器等间距放置于距离红火蚁蚁巢中心1 m处,每个蚁巢放8套红火蚁诱集器,分别放置于蚁巢的8个方位,以避免风向对诱集效果的影响。诱集器放置时,带药的诱集器和空白对照间隔放置。同一蚁巢的试验进行15 min,15 min后将诱集器收回,统计诱集器上的诱集到的红火蚁数量。同一蚁巢的不同浓度的试验间隔2 h,以排除频繁惊扰对红火蚁警觉性和活性的影响。

1.6 数据分析

试验数据使用DPS 9.01软件进行数据分析,采用Origin 2022b软件进行统计图绘制。红火蚁告警信息素2-乙基-3,6-二甲基吡嗪在NRP和PVCP这两种载体中的释放速率对比采用完全随机设计中的二因素有重复试验统计分析,Tukey氏多重比较进行差异显著性分析。2-乙基-3,6-二甲基吡嗪田间诱集效果对比采用单因素方差分析。

2 结果

2.1 红火蚁告警信息素2-乙基-3,6-二甲基吡嗪在不同载体中的释放量

随着萃取时间的延长,NRP载体中相同剂量红火蚁告警信息素2-乙基-3,6-二甲基吡嗪的释放量也随之升高。在中剂量(10 000 ng)下萃取15和30 min、萃取15和60 min间的释放量,在高剂量(100 000 ng)下萃取15和60 min、萃取30和60 min间的释放量表现出显著差异(P<0.05)(表1)。

表1 红火蚁告警信息素2-乙基-3,6-二甲基吡嗪在天然橡胶塞(NRP)载体中的释放量

随着萃取时间的延长,PVCP载体中相同剂量2-乙基-3,6-二甲基吡嗪的释放量也随之升高。无论是在低剂量(1 000 ng)、中剂量(10 000 ng)还是高剂量(100 000 ng),不同萃取时间下的释放量之间均表现出显著差异(P<0.05)(表2)。

表2 红火蚁告警信息素2-乙基-3,6-二甲基吡嗪在PVC管(PVCP)载体中的释放量

2.2 红火蚁告警信息素2-乙基-3,6-二甲基吡嗪在NRP载体中的释放动态和规律

萃取时间(F=87.075,df=4,P=0.0001)和剂量(F=490.098,df=4,P=0.0001)均对红火蚁告警信息素2-乙基-3,6-二甲基吡嗪的释放速率有极显著影响(图1)。相同萃取时间下, 随着剂量的升高, 2-乙基-3,6-二甲基吡嗪在NRP载体中的释放速率也随之升高。而在相同剂量下,随着萃取时间的上升,2-乙基-3,6-二甲基吡嗪在NRP载体中的释放速率逐渐下降。释放速率在15 min时达到最大值。

图1 红火蚁告警信息素2-乙基-3,6-二甲基吡嗪在天然橡胶塞(NRP)载体中的释放速率

2.3 红火蚁告警信息素2-乙基-3,6-二甲基吡嗪在PVCP载体中的释放动态和规律

PVCP中红火蚁告警信息素剂量2-乙基-3,6-二甲基吡嗪对其释放速率有极显著影响(F=17.383,df=4,P=0.0001),而萃取时间对其释放速率没有显著影响(F=0.359,df=4,P=0.7016)(图2)。相同萃取时间下,随着剂量的升高,红火蚁告警信息素在PVCP的释放速率也随之升高,表现出与在NRP载体中相同的释放规律。相同剂量下,在低剂量(1 000 ng)下,随着萃取时间的上升,红火蚁告警信息素在PVCP载体中的释放速率逐渐下降。而相同剂量,在中剂量(10 000 ng)和高剂量(100 000 ng)下,随着萃取时间的上升,2-乙基-3,6-二甲基吡嗪在PVCP中的释放速率也逐渐上升,在萃取时间为60 min时,释放速率达到最大值。

图2 红火蚁告警信息素2-乙基-3,6-二甲基吡嗪在PVC管(PVCP)载体中的释放速率

2.4 红火蚁告警信息素2-乙基-3,6-二甲基吡嗪田间诱集效果

在NRP载体中,与同一剂量空白对照组相比,1 000 ng告警信息素2-乙基-3,6-二甲基吡嗪诱集的红火蚁数量极显著增多(P<0.01),而随着剂量的升高,2-乙基-3,6-二甲基吡嗪诱集的红火蚁数量极显著减少(P<0.01),表现出极显著的驱避作用,浓度越高,驱避作用越显著。各剂量空白对照组间诱集的红火蚁数量无显著差异(P>0.05),但随着剂量的升高,处理组诱集到的红火蚁数量总体呈极显著下降的趋势(P<0.01)(图3)。

图3 红火蚁告警信息素2-乙基-3,6-二甲基吡嗪在田间天然橡胶塞(NRP)载体中诱集到的红火蚁数量

在PVCP载体中,与同剂量空白对照组相比,1 000 ng 2-乙基-3,6-二甲基吡嗪诱集到的红火蚁数量差异不显著(P>0.05);在10 000 ng剂量下,2-乙基-3,6-二甲基吡嗪诱集到的红火蚁数量显著增多(P<0.05);随着剂量进一步升高,100 000 ng 2-乙基-3,6-二甲基吡嗪诱集到的红火蚁数量显著减少(P<0.05),表现出显著的驱避作用,而1 000 000 ng 2-乙基-3,6-二甲基吡嗪诱集到的红火蚁数量极显著减少(P<0.01),表现出极显著的驱避作用;各剂量空白对照组间诱集的红火蚁数无显著差异(P>0.05),随着剂量的升高,处理组诱集到的红火蚁数量从10 000 ng剂量开始呈极显著下降(P<0.01)(图4)。

图4 红火蚁告警信息素2-乙基-3,6-二甲基吡嗪在田间PVC管(PVCP)载体中诱集到的红火蚁数量

结合图3和图4的结果,2-乙基-3,6-二甲基吡嗪在NRP载体中1 000 ng剂量下和在PVCP载体中10 000 ng剂量下对红火蚁有显著的诱集效果,这两个剂量与2.3和2.4节中2-乙基-3,6-二甲基吡嗪在两种载体中15 min时的释放速率对应后可知,两者的释放速率相近,均为25 ng/h左右,进一步印证了上述结果,即释放速率为25 ng/h的2-乙基-3,6-二甲基吡嗪对红火蚁的野外诱集有显著的增强作用。

3 讨论

本研究结果表明,在室内温湿度条件下,红火蚁告警信息素2-乙基-3,6-二甲基吡嗪在NRP载体中和在PVCP载体中释放规律总体呈现出相反的趋势。2-乙基-3,6-二甲基吡嗪在NRP载体中的释放速率随时间增长逐渐变慢(图1),在PVCP载体中的释放速率随时间增长逐渐变快(图2)。从整体上看,在所测定的3个剂量和3个萃取时间下,2-乙基-3,6-二甲基吡嗪在NRP载体中的释放速率明显快于在PVCP载体中的释放速率。我们分析这可能有两方面的原因:一是化合物本身的分子量和结构会影响其在不同载体中的释放,二是NRP和PVCP这两种载体本身的结构差异(朱诚棋等, 2017),导致载体与红火蚁告警信息素之间互作产生的效果不同,进而产生了释放速率的差异。我们认为后者是主要原因。

红火蚁告警信息素2-乙基-3,6-二甲基吡嗪在NRP载体中,1 000 ng剂量下3个萃取时间的萃取量之间均无显著差异, 10 000 ng剂量下萃取30和60 min的释放量之间无显著差异(表1)。我们认为是NRP载体与空气接触面积较大,导致告警信息素在萃取初期便快速释放,在快速释放后,由于此时载体内告警信息素的剂量显著下降,后期释放量也就显著降低。在数据上体现为1 000 ng 2-乙基-3,6-二甲基吡嗪在NRP载体中萃取15 min时即达到释放极限,10 000 ng 2-乙基-3,6-二甲基吡嗪在NRP载体中萃取30 min时即达到释放极限。达到释放极限后,告警信息素在NRP载体中的释放量便不再有显著增加。

在类似的研究中,有将西花蓟马聚集信息素溶于NRP和PVCP两种载体中(李晓维等, 2017; 孙冉冉等, 2020),证实西花蓟马聚集信息素在NRP载体中的释放速率明显快于在PVCP载体中的释放速率,这与本研究的结果一致。不同的是,西花蓟马聚集信息素在这两种载体中的释放速率整体均是随时间增长逐渐变慢,而在本研究中,红火蚁告警信息素2-乙基-3,6-二甲基吡嗪在NRP载体中的释放速率随时间增长逐渐变慢(图1),在PVCP载体中的释放速率随时间增长逐渐变快(图2)。另有研究选取共轭二烯性信息素为材料(刘奎伟等, 2012),探究该种信息素在复合橡胶和聚乙烯管中的释放规律,证实共轭二烯性信息素在复合橡胶中的释放速率随时间增长逐渐变慢,在聚乙烯管中的释放速率随时间增长逐渐变快,这与本研究中红火蚁告警信息素在两种载体中的释放规律相吻合。

关于田间应用红火蚁告警信息素进行红火蚁监测和防治,在此之前尚无相关研究。我们在室内进行的相关研究证实,一定量的红火蚁告警信息素2-乙基-3,6-二甲基吡嗪对红火蚁有显著的引诱作用。本研究证实了1 000 ng 2-乙基-3,6-二甲基吡嗪配合NRP载体使用或10 000 ng 2-乙基-3,6-二甲基吡嗪配合PVCP载体使用均可很好地满足田间快速监测红火蚁的需要。在红火蚁告警信息素的实际应用过程中,仅仅依靠红火蚁告警信息素和缓释载体这两者还是远远不够的。为此,我们需要结合现有成果将红火蚁告警信息素和缓释载体配合红火蚁专用诱集器(张莉丽等, 2020)和专用监测诱饵(陈利民等, 2019)一起使用,这样才能对红火蚁的监测工作起到一定的增效作用。而红火蚁专用监测诱饵在使用的过程中,诱饵的气味(刘晓彤等, 2022)随水分蒸发逐渐下降。因此在配合红火蚁告警信息素和红火蚁专用监测诱饵使用的基础上,结合NRP和PVCP两种载体的特性,我们认为NRP载体适合进行红火蚁的快速监测(Ujiyama and Tsuji, 2018),而PVCP载体适合进行红火蚁的长期监测(Chenetal., 2019; Byeonetal., 2020)。因为在将监测诱饵和红火蚁信息素投放使用的前期,配合NRP载体使用时,监测诱饵的气味和红火蚁告警信息素的释放速率都较高,能够对红火蚁产生极强的吸引作用。而随着时间的推移,监测诱饵的气味释放速率下降,此时如用PVCP作为缓释载体,可以达到前期利用诱饵气味和少量红火蚁告警信息素吸引红火蚁,后期利用红火蚁告警信息素吸引更多红火蚁的效果。在后续的实际应用过程中,我们可以期望将红火蚁告警信息素加载在PVCP载体中,并配合红火蚁专用监测器和专用监测诱饵使用,同时发挥粘虫板的优势,达到精准监测红火蚁的效果,这也是对红火蚁进行精准和有效防治的基础。