Fe3O4@COOH纳米酶比色检测食用纯植物油的过氧化值

栗 鑫，罗 磊，熊蓥姿，王 玲，李脉泉，刘 霞

（湖南农业大学食品科学技术学院，食品科学与生物技术湖南省重点实验室，湖南 长沙 410128）

食用植物油中由于含有大量不饱和脂肪酸，在生产、运输、贮藏过程中易发生氧化，其氧化中间产物氢过氧化物易分解为4-羟基-反式-壬烯醛、巴豆醛、丙二醛等低分子的醛酮类化合物，不仅使油脂的感官品质受损，还具有一定的生理毒性，危害身体健康[1-4]。过氧化值（peroxide value，POV），可以有效反映油脂的氧化程度，即POV越大，表明油脂氧化生成的氢过氧化物的量越多[5]。我国在GB 5009.227—2016《食品中过氧化值测定》[6]中规定：食用植物油的POV应不高于0.25 g/100 g。

目前，国内外检测食用植物油POV的方法主要有碘量法[7]、光谱法[8]、色谱法[9]、电化学酶促分析法[10-11]等。碘量法虽简单易行，但测定过程中易受人为因素的影响，如摇晃速率、滴定终点的确定等，导致检测结果重复性差。光谱法主要有傅里叶变换红外光谱和荧光光谱。傅里叶变换红外光谱具有测试时间短、操作成本低、预处理简单等明显优势，但其模型可靠性和专一性还需进一步优化[12]。荧光光谱法灵敏度高、样品用量少，但容易受到干扰[13]。色谱法以高效液相色谱为主，简单灵敏，选择不同的色谱柱和检测器，能分析具有不同特性、不同分子质量或极性的油脂[14]，但检测时间长[15]。此外，光谱法与色谱法都需应用大型仪器，检测成本高，且检测方法不够便捷。酶促分析法中，过氧化物酶传感器应用居多[16]。Jia Jianbo等[17]研究了基于辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）制备的酶电极，将其应用于植物油POV的测定，取得了满意的结果。但HRP存在着对环境敏感、成本高等问题。

纳米酶是一种具有天然酶催化活性的纳米材料，在生理条件下可有效催化底物的转化，并遵循天然酶的酶促动力学[18]。Fe3O4纳米酶是最早被发现具有类过氧化物酶（peroxidase，POD）催化活性的材料，具有容易制备、性质稳定、超顺磁性等特性。Fe3O4纳米酶表面含有丰富的Fe2＋、Fe3＋，两者间的相互转换是其释放催化活性的关键。如图1所示，酸性条件下，Fe3O4纳米酶中的Fe3＋能与氢过氧化物（如H2O2）反应，生成不稳定的FeOOH2＋离子基，该离子基进一步分解成Fe2＋，再与H2O2反应生成羟自由基[19]，羟自由基可氧化显色底物，如3,3′,5,5′-四甲基联苯胺（3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine，TMB）和2,2′-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate)，ABTS）。TMB的氧化产物，即氧化态TMB（oxidation-TMB，ox-TMB）呈蓝色，其最大吸收波长为652 nm。Ding Ning等[20]基于Fe3O4纳米酶的类POD活性，以ABTS为显色底物，建立了Fe3O4纳米酶-H2O2-ABTS的比色传感体系，用于检测乳制品中的三聚氰胺。Re Hejun等[21]制备了一种表面修饰有VC的Fe3O4纳米酶，并将其作为催化剂，构建了一种用于检测H2O2和葡萄糖的比色传感器。

图1 Fe3O4纳米酶催化反应机理Fig.1 Mechanism of reactions catalyzed by Fe3O4 nanozyme

本研究基于表面修饰羧基的Fe3O4纳米酶（Fe3O4@COOH）的类POD活性，以TMB为显色底物，构建一种用于检测食用纯植物油中POV的简单快速、灵敏高效的新型比色方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

食用纯植物油（压榨、一级）：玉米油、花生油、葵花籽油、菜籽油、大豆油 长沙市步步高超市。

四水合氯化亚铁（FeCl2·4H2O）、六水合三氯化铁（FeCl3·6H2O）、氢氧化钠（NaOH）、一水柠檬酸（C6H10O8·H2O）、乙酸、乙醇、30%过氧化氢（H2O2）、三水合乙酸钠（CH3COONa·3H2O）、二甲亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、三氯甲烷（CHCl3）、冰乙酸（CH3COOH）上海国药集团化学试剂有限公司；TMB（纯度≥99%）上海瑞永生物科技有限公司；HRP（活性＞300 U/mg）上海麦克林生化科技有限公司；Fe3O4@COOH纳米酶由本实验室自制；氮气 长沙长钢气体厂；汝铁硼强磁铁 长沙南湖五金机电市场；实验所用试剂均为分析纯及以上，实验用水为超纯水。

1.2 仪器与设备

Multiskan GO 1510多功能酶标仪 美国Thermo Scientific公司；KQ-250DE超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；DZF-6030A真空干燥箱 上海恒一科学仪器有限公司；XMTD-702便携式恒温箱 常州市凯奥仪器有限公司；AUY 220分析天平 日本岛津公司；移液枪 大龙兴创实验仪器公司；WGZ-9070B鼓风干燥箱 上海科恒仪器有限公司；紫外灯箱为实验室（2.0 A、30 W）均由本实验室自制。

1.3 方法

1.3.1 Fe3O4@COOH纳米酶类POD催化活性的验证

Fe3O4@COOH纳米酶的制备是在实验室现有方法上稍加优化[22]。过程如下：准确称取5.0 g FeCl3•6H2O、2.0 g FeCl2•4H2O，超声溶解在100 mL超纯水中，通氮除氧，水浴加热至80 ℃，加入40 mL NaOH溶液（2 mol/L）、1.1 g柠檬酸，在550 r/min反应1 h。待反应结束后，冷却至室温，在外部磁场作用下使用超纯水洗涤至中性，于60 ℃条件下真空干燥24 h后备用。

H2O2存在下，研究Fe3O4@COOH纳米酶对底物TMB的催化氧化能力。将800 μL乙酸盐缓冲液（0.2 mol/L，pH 3.5）于离心管中，依次加入50 μL Fe3O4@COOH纳米酶水溶液（1 mg/mL）、100 μL H2O2（0.08 mol/L）和50 μL TMB（0.008 mol/L），加入50 μL DMSO溶解，混合均匀，在室温下反应5 min后，在外部磁力作用下分离Fe3O4@COOH纳米酶，然后吸取100 μL上清液置于酶标板中，扫描其在550～750 nm范围内的吸收光谱。

1.3.2 Fe3O4@COOH纳米酶比色检测POV条件优化

反应条件优化的参数如表1所示，方法与1.3.1节相同。每个实验平行测定3 次。

表1 反应条件的优化Table 1 Optimization of reaction conditions

1.3.3 Fe3O4@COOH纳米酶的酶促动力学分析

首先，固定H2O2浓度（0.08 mol/L），改变TMB浓度。将反应总体积缩小为原来的1/5，依次往酶标板中加入160 μL乙酸盐缓冲液（0.2 mol/L，pH 2）、20 μL Fe3O4@COOH纳米酶（1 mg/mL）、40 μL H2O2以及20 μL TMB（不同浓度），混合均匀，在652 nm波长处进行吸光度的测定。每隔30 s测定一次，以吸光度随时间变化曲线斜率的倒数为纵坐标，以TMB浓度倒数为横坐标绘图，得到Fe3O4@COOH纳米酶对TMB的双倒数图，再根据公式：1/V=（Km/Vmax）（1/[S]）＋1/Vmax计算出米氏常数（Km）和最大反应速率（Vmax）[23]。

类似地，固定TMB浓度（0.8 mmol/L），改变H2O2浓度。检测过程与数据处理方法同上。

1.3.4 Fe3O4@COOH纳米酶的重用性及贮藏性

将制备好的Fe3O4@COOH纳米酶置于4 ℃条件下冷藏保存，采用1.3.1节的方法，考察其重复使用性及贮藏性能。

1.3.5 基于Fe3O4@COOH纳米酶比色测定食用纯植物油POV的可行性

1.3.5.1 纯植物油提取液

准确称取3.0 g（精确到0.01 g）植物油，溶解于30 mL三氯甲烷-冰乙酸混合溶液（4∶6，V/V）中，混合均匀后，加入100 mL超纯水，静置1 min，待溶液分层后，吸取下层溶液至离心管中，获得食用纯植物油提取液。

1.3.5.2 POV的检测

采用GB 5009.227—2016对食用纯植物油提取液，进行POV的测定，同时采用Fe3O4@COOH纳米酶比色法检测食用纯植物油原液和食用纯植物油提取液的POV，比较检测结果。

1.3.6 基于Fe3O4@COOH纳米酶比色检测食用植物油POV的方法建立

取200 μL不同种类纯植物油，分别采用国家标准方法与比色法进行POV检测，以比色法测得的吸光度为横坐标，POV为纵坐标，建立油样吸光度与POV的关系曲线。

1.3.7 不同氧化方式对食用纯植物油POV比色检测的影响

紫外氧化：准确吸取100 mL食用纯植物油（玉米油、花生油、葵花籽油、菜籽油、大豆油）倒入烧杯中，将烧杯放入紫外灯箱中，经紫外灯照射进行氧化。

烘箱氧化：同上，试样放入电热高温干燥箱中，80 ℃氧化。

自然氧化：同上，试样于室温下自然氧化。

其中，每间隔一定时间从烧杯的上、中、下三层共取出5 mL油样，混匀后，分别应用1.3.6节建立的方法和国家标准方法，对其进行POV的检测。

1.3.8 实际油样的检测

采用玉米、花生、葵花籽、菜籽、大豆油5 种纯植物油作为实际样品。分别应用所建的比色检测方法和国家标准方法对其进行POV的检测，并比对其检测结果。

1.4 数据处理

数据处理分析采用软件OriginPro、Excel、SPSS和Photoshop，其中线性回归方程、作图使用OriginPro和Photoshop，重复性、偏差值、回收率采用SPSS、Excel处理数据。

2 结果与分析

2.1 Fe3O4@COOH纳米酶类POD催化活性的验证

本实验室合成的Fe3O4@COOH纳米酶粒径平均值约为6.6 nm，如图2所示。

图2 Fe3O4@COOH纳米酶的透射电镜图Fig.2 TEM image of Fe3O4@COOH

如图3所示，当反应体系中同时存在Fe3O4@COOH纳米酶、H2O2和TMB时，该体系在500～750 nm波长范围内出现了较强的吸收峰；当反应体系中不存在Fe3O4@COOH纳米酶时，相同时间内，并未出现明显的吸收峰，这说明Fe3O4@COOH纳米酶能够催化H2O2氧化TMB。此外，当反应体系中存在TMB时，均会出现较弱的吸收峰，但吸光度显著低于Fe3O4@COOH纳米酶-H2O2-TMB反应体系，原因可能是TMB受到溶液及空气中的氧气影响，发生了微弱的氧化。但反应体系中不存在TMB时，则并未出现明显的吸收峰。上述结果表明，本研究制备的Fe3O4@COOH纳米酶具有类POD的催化活性，且以TMB作为显色底物时，其最大吸收峰波长为652 nm。

图3 不同反应体系的吸收光谱Fig.3 Absorption spectra of different reaction systems

2.2 比色检测条件的优化

为获得最佳比色检测条件，研究乙酸盐缓冲液体积、缓冲液pH值、TMB浓度、Fe3O4@COOH纳米酶质量浓度、反应时间等因素对Fe3O4@COOH纳米酶催化活性的影响。

首先，探究乙酸盐缓冲液体积对显色效果的影响（固定反应体系总体积）。如图4A所示，反应溶液吸光度随乙酸盐缓冲液体积的增加而增加，当乙酸盐缓冲液体积为800 μL时，其吸光度最大。之后，反应溶液吸光度没有出现明显变化，故选择800 μL乙酸盐缓冲液进行后续实验。

图4 乙酸盐缓冲液体积（A）、pH值（B）、TMB浓度（C）、Fe3O4@COOH纳米酶质量浓度（D）、反应时间（E）对显色效果的影响Fig.4 Effects of acetate buffer volume (A),pH (B),TMB concentration (C),concentration of Fe3O4@COOH nanozyme (D) and reaction time (E) on coloration

从图4B可以看出，随pH值的升高，反应体系的吸光度也随之增加，当pH 3时，反应体系显示出最大吸光度。之后，反应体系的吸光度随pH值的增加而降低。这是在酸性环境下时，Fe3O4@COOH纳米酶表现出类POD的催化活性[24-25]。故反应体系的最佳pH值为3。

显色底物TMB浓度是影响比色反应的重要因素，结果如图4C所示。当TMB浓度增加时，其吸光度随之升高。当TMB浓度为0.08 mol/L时，其吸光度达到最大。之后，即使TMB浓度继续增大，反应体系的吸光度并未出现明显变化，原因可能是Fe3O4@COOH纳米酶与H2O2反应释放出羟自由基，后者与TMB发生氧化反应，当底物量趋于饱和时，颜色变化趋于稳定，其增长变化趋势符合酶与底物结合反应过程曲线[26]。故选择0.08 mol/L TMB进行后续实验。

Fe3O4@COOH纳米酶质量浓度直接影响反应体系的显色效果，结果如图4D所示。反应体系的吸光度随Fe3O4@COOH纳米酶质量浓度的增加而增加。当Fe3O4@COOH纳米酶质量浓度为1 mg/mL时，吸光度达到较大水平，之后，吸光度的变化不明显，可能原因是反应体系中酶与底物已结合完全，故选择1 mg/mL Fe3O4@COOH纳米酶进行后续实验。

反应时间影响体系的显色效果，结果如图4E所示，随着反应时间的延长，反应体系的吸光度也随之增加。当反应时间为10 min时，反应体系的吸光度达到最大，之后，随着反应时间的延长，反应体系的吸光度逐渐下降，超过10 min后，蓝色氧化产物ox-TMB呈现不稳定状态，进一步分解为其他物质，使得反应体系的颜色逐渐变浅，其吸光度也随之降低。考虑到检测方法的适用性，以及连续大批量检测的需要，故选择5 min作为本方法的显色反应时间。

2.3 Fe3O4@COOH纳米酶的酶促动力学分析

通过酶促动力学实验，进一步研究Fe3O4@COOH纳米酶的类POD催化活性（图5），获得的米氏常数（Km）和最大反应速率（Vmax）见表2，其中，Fe3O4@COOH纳米酶对H2O2和TMB的Km值分别为0.315、0.702 mmol/L。Km值代表酶与底物的亲和能力，Km值越小，表明酶与底物的亲和能力越高。从表2得知，Fe3O4@COOH纳米酶对H2O2和TMB的Km值均低于HRP，说明Fe3O4@COOH纳米酶相较于HRP而言，对H2O2和TMB的亲和力更高，可能是由于所制备的Fe3O4@COOH纳米酶粒径小、比表面积大、表面带有丰富的负电荷，能结合更多的H2O2和TMB。相较于HRP与底物具有更强的结合能力[27-28]。但其Vmax略低于HRP，表明其催化反应速率与天然酶相比存在一定差距。相较于Fe3O4纳米酶和表面修饰其他物质的Fe3O4纳米酶而言，Fe3O4@COOH纳米酶对H2O2和TMB的亲和力较弱，表中表面不同修饰的Fe3O4纳米酶对底物的亲和力也有不同程度的降低，这是由于Fe3O4纳米酶的催化活性位点主要分布在其表面，表面修饰后，其活性位点部分被覆盖，导致该纳米酶的催化活性有所降低。但修饰后的Fe3O4@COOH纳米酶稳定性与分散性更佳，不易发生聚集，这也从另一个方面提升了Fe3O4@COOH纳米酶的催化稳定性与活性[29]，且有利于实际应用。此外，虽然本研究所应用的Fe3O4@COOH纳米酶对底物的反应速率，不及Au、MnO2、C修饰的Fe3O4，但是其制备简单、成本低，能够满足比色检测的需要。

图5 Fe3O4@COOH纳米酶酶促动力学分析Fig.5 Enzymatic kinetic analysis of Fe3O4@COOH nanozyme

表2 各种纳米材料与HRP的Km和VmaxTable 2 Km and Vmax values of nanomaterials and HRP

2.4 Fe3O4@COOH纳米酶的重复使用性及贮藏性

如图6所示，该纳米酶经5 次显色-干燥-再显色的循环反应后，反应体系的吸光度未出现明显变化，说明所制备的Fe3O4@COOH纳米酶催化活性稳定，具有可重复使用性，这是由于Fe3O4@COOH纳米酶具有良好的超顺磁性，能够在每次显色反应完成后，借助外部磁力作用回收，相较于HRP而言更加经济。

图6 Fe3O4@COOH纳米酶重复使用次数Fig.6 Reusability of Fe3O4@COOH nanozyme

使用冷藏（4 ℃）保存不同时间的Fe3O4@COOH纳米酶进行比色反应（图7），发现反应体系的吸光度无明显变化，表明Fe3O4@COOH纳米酶在冷藏条件下保存50 d后，仍表现出良好的类POD催化活性，即具有较好的稳定性。

图7 Fe3O4@COOH纳米酶的保存时间Fig.7 Storage stability of Fe3O4@COOH nanozyme

2.5 Fe3O4@COOH纳米酶比色检测食用纯植物油POV的可行性

如图8所示，无论是食用纯植物油提取液，还是食用纯植物油原液，Fe3O4@COOH纳米酶均可催化油脂中过氧化物，并与TMB发生显色反应。但食用纯植物油原液的反应溶液颜色，明显深于植物油提取液的反应溶液颜色，且反应溶液在500～750 nm波长范围内，均产生了明显的吸收峰，且前者的吸收峰明显强于后者的吸收峰（图9）。这或许是食用纯植物油经有机溶剂提取后，其所含的过氧化物部分被分解所致。上述结果说明，采用食用纯植物油原液＋Fe3O4@COOH纳米酶＋TMB的反应体系，可实现食用植物油中POV的检测，不仅省时且更加准确。

图8 植物油和提取液与TMB反应前后的溶液颜色变化Fig.8 Color changes of vegetable oil and its extract before and after reaction with TMB

图9 食用纯植物油原液、植物油提取液的吸收光谱图Fig.9 Absorption spectra of edible vegetable oil and its extract

2.6 Fe3O4@COOH纳米酶比色法检测食用纯植物油的POV

2.6.1 比色法检测食用纯植物油POV方法的建立

以紫外照射不同时间的纯植物油作为样品，在最佳比色检测条件下，采用食用纯植物油原液＋Fe3O4@COOH纳米酶＋TMB的反应体系，对其吸光度进行测定，同时采用国家标准方法对同一样品进行POV的测定。如图10所示，不同种类食用纯植物油的POV在0～0.30 g/100 g范围内，与其吸光度之间均呈现出良好的线性关系。但斜率不同，这或许是由于不同种类的食用植物油成分差异，生成的过氧化物类型不同[35]。

图10 比色法检测玉米油（A）、花生油（B）、葵花籽油（C）、菜籽油（D）、大豆油（E）POV的线性关系及照片Fig.10 Linear relationships between POV and absorbance of corn oil (A),peanut oil (B),sunflower oil (C),rapeseed oil (D) and soybean oil (E)

2.6.2 Fe3O4@COOH纳米酶比色检测不同氧化方式油样的POV

经过3 种氧化方式（紫外灯照射、烘箱加热、自然放置）的油样的POV分别为0.32、0.28、0.29，吸光度分别为0.577 9、0.568 3、0.599 1（图11）。在POV较为稳定的情况下，经过3 种不同氧化方式的油样的吸光度稳定在0.58左右，相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）分别为4.56%、6.14%、5.82%，表明所构建的基于Fe3O4@COOH纳米酶的比色检测方法，适用于不同方式氧化的食用纯植物油POV检测。

图11 不同氧化方式下的植物油吸光度与POVFig.11 Absorbance and POV of vegetable oil oxidized by different methods

2.6.3 实际样品的检测

采用所构建的比色法和滴定法（国家标准方法），分别对5 种未知氧化程度的食用纯植物油（玉米油、花生油、葵花籽油、菜籽油、大豆油）进行POV的测定。结果表明（表3），两种方法的检测结果接近，差值均在0.05以下，不影响最终结果的判定。此外，5 种油样的POV，两种测定方法的RSD分别为6.13%、5.84%、6.82%、3.62%、5.75%。这说明本研究构建的比色法具有良好的准确度，可用于纯植物油中POV的定量检测。

表3 不同方法测定食用油的POVTable 3 POV of oil samples measured by different methods

图12为实际食用油样品反应后的颜色（在国家标准中规定的食用植物油POV限定值（0.25 g/100 g）附近）。玉米油、花生油、葵花籽油、大豆油反应后色泽均为蓝色，虽然菜籽油反应后见少许原油颜色，但并未影响其在652 nm波长处的吸光度。

图12 食用油反应后颜色Fig.12 Color changes of edible oil after reaction

3 结论

本研究基于Fe3O4@COOH纳米酶的类POD催化活性，建立了检测食用纯植物油POV的比色法。所制备的Fe3O4@COOH纳米酶，对H2O2和TMB具有强亲和力，在4 ℃冷藏保存50 d仍表现出较强的催化活性，可重复使用。在最佳检测条件下，5 种食用纯植物油的POV（0～0.3 g/100 g）与其比色方法的吸光度具有良好线性关系。无论对未知POV的食用纯植物油，还是对不同氧化方式（紫外灯照射、烘箱加热、自然放置）处理后的食用纯植物油，比色法均给出了准确的检测结果，表明本研究构建的比色法对食用植物油POV测定具有良好的实用性。

本方法操作简单、反应现象明显，且所使用的Fe3O4@COOH纳米酶具有超顺磁性，只需施加外部磁场即可分离重复使用，检测成本低，具有较大的实用前景。但Fe3O4@COOH纳米酶容易受温度影响，因此需进一步拓宽其温度适用范围。此外，人们饮食中也常用到调和油，如何将所建立的方法应用在调和油的POV测定中，也是未来需要研究的方向。