天山雪莲总酚酸对脂多糖刺激的RAW264.7细胞炎症因子释放的影响及其机制研究△

颜丽珊，邱新宇a，康建英，顾春宇，张硕峰，张超，王亦巍，孔静，罗赣*，张翼*

1.北京中医药大学 中药学院，北京 102488；2.北京远大九和药业有限公司，北京 102433

炎症反应是机体免疫应答中的重要部分，可被外源性病原体相关分子模式或内源性的损伤相关分子模式激活，促进免疫细胞的募集，进而启动高效的组织修复[1]。同时，炎症反应参与疾病发生发展。在疾病急性发作期间，组织常驻细胞感知炎性刺激物，释放大量细胞因子、趋化因子、自由基等炎症介质，募集中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核巨噬细胞等到达病灶，释放更多炎症因子，导致免疫失衡[2]。在类风湿性关节炎、动脉粥样硬化等慢性炎症性疾病中，巨噬细胞、淋巴细胞和浆细胞等的长期浸润可导致组织损伤、纤维化甚至失去功能[3]。可见，改善炎症反应是治疗炎性疾病的关键策略之一。

天山雪莲（Saussureae Involucratae Herba）是维吾尔族常用药，具有温肾助阳、祛风胜湿、通经活血的功效，临床上用于治疗关节炎[4]、类风湿性关节炎[5]、腱鞘炎[6]、胰腺炎[7]等疾病。现代研究显示天山雪莲含有黄酮、酚酸、木脂素、苯丙素类化合物等多种活性成分[8]，具有抗炎[9-10]、抗氧化[11]、抗肿瘤[12-13]、改善脂代谢[14]等药理作用。《中华人民共和国药典》2020 年版中规定芦丁、绿原酸为天山雪莲的质量控制成分[15]。本课题组前期研究结果表明天山雪莲富含芦丁的黄酮有效部位具有良好的抗炎活性[16]，而天山雪莲富含绿原酸的总酚酸类成分抗炎作用尚不明确。因此，本研究运用脂多糖（LPS）诱导的RAW264.7 细胞炎症模型，在体外探讨天山雪莲总酚酸（PSI）抗炎的作用及其机制，有利于开发利用天山雪莲资源。

1 材料

1.1 细胞

小鼠巨噬细胞RAW264.7 细胞株由北京中医药大学朱枝祥副教授惠赠。

1.2 样品

天山雪莲购自新疆当地市场，经北京中医药大学罗赣副教授鉴定为Saussurea involucrata（Kar.et Kir.）Sch.-Bip的干燥地上部分。

1.3 试药

绿原酸对照品（批号：A22GB158496，纯度≥98%）购于上海源叶生物技术科技有限公司；芦丁对照品（批号：100080-201811，纯度≥98%）购自中国食品药品检定研究院；分析级乙醇、甲醇、甲酸、氢氧化钠和盐酸购于北京化工厂；Griess 试剂（批号：SLBZ0827）、LPS（批号：0000110441）、二甲基亚砜（DMSO，批号：WXBD4591V）购于美国Sigma 公司；噻唑蓝（MTT，批号：0793）、牛血清白蛋白（BSA，批号：0332060311）、制胶溶液（批号分别为4680083111、4880070211、3291040121）和脱脂奶粉（批号：7861012421）购于北京兰博利德商贸有限公司；DMEM 高糖培养基（批号：2233206）、青霉素-链霉素双抗试剂（批号：2149393）、胎牛血清（FBS，批号：2233207）、磷酸盐缓冲液（PBS，批号：2233203）、0.25%胰蛋白酶（批号：2231188）购于以色列Biological Industries 公司；4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）抗猝灭封片剂（批号：D4911830）购于上海翊圣生物科技有限公司；RIPA 裂解液（批号：092120201120）购于上海碧云天生物技术有限公司；前列腺素E2（PGE2）酶联免疫吸附法（ELISA）试剂盒（批号：011071907B）购于英国Enzo Life Sciences公司；白细胞介素-6（IL-6，批号：219273-001）、IL-10（批号：178229001）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α，批号：20499005）、趋化因子单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1，批号：214571002）、巨噬细胞炎症蛋白-1α（MIP-1α，批号：221767-001）、色谱级乙腈（批号：212213）、调节激活正常T 细胞表达分泌因子（Rantes，批号：189155002）ELISA 试剂盒购于美国Thermo Fisher 公司；核蛋白提取试剂盒（批号：20211217）购于北京索莱宝科技有限公司；化学发光底物（ECL）溶液（批号：180-5001）购于上海天能科技有限公司；一抗β-肌动蛋白（βactin）、核转录因子（NF）-κB/p65、磷酸化（p）-NF-κB/p65、κB 抑制因子（IκB）α、p-IκBα、p-IκB激酶（IKK）α/β、TANK 结合激酶1（TBK1）、p-TBK1、c-Jun、p-c-Jun、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）p38、p-p38、胞外信号调节激酶（ERK）1/2、p-ERK1/2、c-jun N-末端激酶（JNK）、p-JNK抗体、Alexa 488 山羊抗兔二抗和辣根过氧化氢酶（HRP）山羊抗兔二抗均购于美国CST 公司；一抗IKKα（批号：#D0717）、特异性蛋白-1（Sp1，批号：#B1317）购于美国Santa Cruz 公司；一抗干扰素调节因子3（IRF3）抗体（批号：GR3257922-1）、山羊抗小鼠二抗（批号：GR3395730-9）购于英国Abcam公司；P-IRF3抗体（批号：04866#220）购于亚诺法生技股份有限公司。

1.4 仪器

AB-8 型大孔树脂（南开大学化工厂）；ACQUITY UPLC® HSS T3色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）和Van Guard™ Pre-Column（1.8 μm）均购于美国沃特世公司；FD-1D-80 型真空冷冻干燥机（北京博医康实验仪器有限公司）；Milli-Q®Reference 超纯水系统（美国Millipore 公司）；Heracell 150I 型二氧化碳恒温细胞培养箱（美国Thermo Fisher 公司）；BJ-2CD 型超净工作台（上海博迅公司）；Spectrostar Nano 型酶标仪（德国BMG LABTECH 公司）；5810R 型台式高速冷冻离心机（德国艾本德公司）；UltraVIEW VOX 型转盘式激光共聚焦显微镜（美国PerkinElmer 公司）；SIMF140BDL 型制冰机（日本松下公司）；5200 型多道化学发光成像系统（上海天能科技有限公司）；PowerPac HC型电泳仪（美国Bio-Rad公司）。

2 方法

2.1 PSI的富集

称取天山雪莲70 g并粉碎，加入70%乙醇700 mL回流提取，重复3 次，每次1 h。用纱布滤过后，采用旋转蒸发仪回收溶剂，并于60 ℃真空干燥，得到天山雪莲乙醇提取物（17.82 g，出膏率25.46%）。AB-8 型大孔树脂使用前用乙醇浸泡过夜，再用水洗至无醇味。依次用5%氢氧化钠溶液和5%盐酸浸泡5 h，然后水洗至中性，于60 ℃过夜干燥。预处理后的树脂湿法装柱（100 cm×3.5 cm），径高比为1∶8，柱体积（BV）为270 mL。将天山雪莲乙醇提取物16 g 与水50 mL混合并超声30 min，然后注入树脂柱中，流速为2 BV·h-1。4 BV 水洗涤后，依次用15%乙醇和40%乙醇各6 BV在室温下洗脱，收集第4 BV的水洗脱液和15%乙醇洗脱液，在60 ℃真空干燥，得到PSI冻干粉（949.9 mg）。

2.2 天山雪莲乙醇提取物、PSI 中绿原酸和芦丁的含量测定

2.2.1 供试品溶液制备 分别精密称取天山雪莲乙醇提取物0.023 9 g 及PSI 0.005 4 g，置于10 mL 量瓶中，加50%甲醇超声溶解并稀释至刻度，摇匀，即分别得天山雪莲乙醇提取物供试品溶液和总酚酸供试品溶液。

2.2.2 对照品溶液制备 精密称取绿原酸对照品4.41 mg，置于10 mL量瓶中，加50%甲醇超声溶解并稀释至刻度，摇匀，制成质量浓度为0.441 mg·mL-1的绿原酸母液。精密称取芦丁对照品3.26 mg，置于10 mL 量瓶中，加50%甲醇超声溶解并稀释至刻度，摇匀，制成质量浓度为0.326 mg·mL-1的芦丁母液。精密移取绿原酸母液290 μL、芦丁母液770 μL至同一个2 mL量瓶中，加50%甲醇定容至刻度，摇匀，即得绿原酸质量浓度为63.945 μg·mL-1、芦丁质量浓度为125.51 μg·mL-1的混合对照品溶液。

2.2.3 色谱条件 采用ACQUITY UPLC® HSS T3色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）和Van Guard™Pre-Column（1.8 μm）进行乙醇提取物、总酚酸中芦丁和绿原酸的含量测定。流动相为乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脱（0～6 min，5%～9%A；6～12 min，9%～13%A；12～19 min，13%～16%A；19～28 min，16%～17%A；28～40 min，17%～28%A），流速为0.3 mL·min-1，柱温为30 ℃，进样体积为5 µL，检测波长为340 nm。

2.3 细胞培养及分组

RAW264.7 细胞用含10% 血清和1% 双抗的DMEM 完全培养基在37 ℃、5% CO2培养箱中培养。待培养皿中的细胞覆盖率达到70%～80%时进行传代或分盘。PSI冻干粉用PBS溶解，经0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，得到PSI 母液，存储于-20 ℃备用。将细胞分为对照组、LPS 组和PSI 不同质量浓度给药组。

2.4 MTT法检测细胞活性

将RAW264.7 细胞接种于96 孔板，每孔6×103个细胞，实验组分别加入不同质量浓度（6.25、12.50、25.00、50.00、100.00、200.00、300.00、400.00 μg·mL-1）的PSI孵育1 h。除对照组外，各组加入LPS（终质量浓度为1 μg·mL-1）孵育24 h 后，每孔加入5 mg·mL-1的MTT 溶液（终质量浓度为0.5 mg·mL-1）10 μL，在37 ℃孵育3 h。弃上清液，用100 µL/孔DMSO 溶解结晶。在酶标仪570 nm 测量每孔的吸光度。

2.5 Griess法检测一氧化氮（NO）释放水平

将RAW264.7 细胞接种于24 孔培养板上，每孔2.5×105个细胞，实验组分别加入不同质量浓度PSI孵育1 h。除对照组外，每孔加入LPS（终质量浓度为1 μg·mL-1）培养24 h后收集细胞培养液，-20 ℃储存。96 孔板每孔加入培养液100 µL，再加入Griess 试剂100 µL，在室温孵育10 min 后，在酶标仪540 nm 测定吸光度，利用NaNO2标准曲线计算NO的生成量。

2.6 ELISA检测炎症因子释放水平

按照各ELISA 试剂盒说明书进行操作。反应板经过封闭，加入对照品溶液或细胞培养液样品孵育，洗板后加入生物素标记抗体孵育，洗板后加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液，洗板后加底物溶液，避光显色5～15 min。每孔加入终止溶液，终止反应。在酶标仪450 nm 测定各孔吸光度，根据标准曲线折算出每孔光密度对应的炎症因子浓度。

2.7 蛋白免疫印迹（Western blot）检测蛋白表达水平

将RAW264.7细胞接种于60 mm培养皿中，实验组分别加入不同质量浓度的PSI，孵育1 h。除对照组外，各组加入LPS 刺激30 min 后，收集细胞。加入RIPA 裂解液，冰浴裂解，在12 000 r·min-1离 心10 min（离心半径为9.5 cm），上清液为细胞总蛋白；或按照核蛋白提取试剂盒说明书操作，分离提取细胞浆蛋白与核蛋白。Bradford 法测定蛋白浓度，98 ℃变性，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）凝胶电泳、聚偏二氟乙烯（PVDF）膜电转，5%脱脂奶粉封闭液室温孵育1 h，加入相应的一抗，4 °C 孵育过夜后，洗涤3 次，二抗孵育1 h，洗涤3 次。条带于ECL 显色液中孵育，使用多道化学发光成像系统曝光显影并拍照。条带图像用ImageJ 1.52r 软件进行灰度分析，并除以内参蛋白β-actin或Sp1灰度值，得到待测蛋白的相对表达水平。

2.8 免疫荧光检测蛋白定位

将RAW264.7 细胞种于4 孔腔室载玻片中，每孔1×104个细胞，实验组分别加入不同质量浓度PSI，孵育1 h。除对照组外，各组加入LPS 刺激30 min后，进行固定透膜，2% BSA 溶液封闭1 h，加入一抗于4 ℃孵育过夜。洗涤3 次，用Alexa Fluor488 标记的二抗室温避光孵育1 h。使用DAPI 抗猝灭封片剂染色封片之后，采用激光共聚焦显微镜观察拍照。

2.9 统计学方法

采用GraphPad Prism 9.0软件进行数据分析和作图，实验数据采用（）表示，采用单因素方差分析，两两比较采用Dunnett后续多重比较检验组间差异，P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 基于超高效液相色谱法（UPLC）的PSI 中绿原酸与芦丁的含量测定

采用UPLC 对天山雪莲乙醇提取物、PSI 中的绿原酸和芦丁含量进行测定[16]。如图1所示，天山雪莲乙醇提取物含有绿原酸和芦丁，质量分数分别为1.99%和2.67%。PSI中绿原酸质量分数为23.60%，相较乙醇提取物，绿原酸含量大幅度提升，但未检测到芦丁，说明大孔吸附树脂可以有效富集天山雪莲中的酚酸类成分。

图1 天山雪莲乙醇提取物、PSI中绿原酸和芦丁的UPLC图

3.2 PSI 对LPS 刺激的RAW264.7 细胞炎症因子释放的影响

如图2A所示，PSI质量浓度为6.25～400 μg·mL-1时对RAW264.7 细胞活力无显著影响，故选用12.50、25.00、50.00、100.00 μg·mL-1作为PSI 给药质量浓度。在LPS刺激下，RAW264.7细胞释放的NO 水平显著升高（P<0.01），PSI 质量浓度为12.5～100 μg·mL-1时能显著降低细胞培养基中的NO 含量（P<0.05，P<0.01）。PSI 同时能剂量依赖性地抑制LPS 诱导的RAW264.7 细胞释放PGE2（图2B）。LPS 能促进RAW264.7 细胞细胞因子（TNF-α、IL-10 和IL-6）和趋化因子（MCP-1、MIP-1α和Rantes）的产生，PSI 能显著抑制上述细胞因子和趋化因子生成（图2C）。结果表明，PSI 能够抑制LPS诱导的RAW264.7细胞炎症因子的释放。

3.3 PSI 对Toll 样受体4（TLR4）信号通路关键蛋白表达的影响

TLR4在包括巨噬细胞在内的大多数细胞表面表达，能够识别LPS，介导其所引起的一系列信号级联反应，促进下游转录因子的活化，进而释放出大量的炎症因子，促进炎症反应的发生发展[17]。进一步采用Western-blot 法检测PSI 对TLR4 信号通路关键蛋白的影响。如图3 所示，LPS 刺激后，RAW264.7 细 胞 IκBα、IKKα/β、p65、TBK1、ERK1/2、JNK、p38、及c-Jun的磷酸化水平明显提高（P<0.05，P<0.01），PSI 质量浓度为50、100 μg·mL-1时能剂量依赖性地降低除JNK 以外上述蛋白的磷酸化表达水平。此外，在LPS 刺激下，RAW264.7 细胞IRF3 磷酸化水平与对照组相比升高，但差异无统计学意义，而PSI 能显著降低IRF3的磷酸化（P<0.05，P<0.01）。上述结果说明PSI能抑制LPS诱导的RAW264.7细胞TLR4信号通路的激活。

图3 PSI对LPS刺激的RAW264.7细胞TLR4信号通路关键蛋白表达的影响

3.4 PSI对p65、IRF3和c-Jun入核的影响

在LPS的刺激下，TLR4信号通路下游转录因子p65、IRF3 和c-Jun 能从胞浆转位至细胞核中，与DNA 结合，从而促进炎症因子的表达[18]，因此，分别采用Western blot 和免疫荧光技术检测p65、IRF3和c-Jun 在RAW264.7 细胞中核转位情况。如图4A～4C 示，LPS 刺激后，p65、IRF3 和c-Jun 在细胞质分布减少，核内分布增多。而PSI 质量浓度为50.00、100.00 μg·mL-1时能够剂量依赖性地抑制p65、IRF3和c-Jun 的入核。此外，如图4D、图4E 所示，发现LPS 显著促进p65、IRF3 和c-Jun 在细胞核内的表达水平（P<0.01），而PSI剂量依赖性地降低其在核内的表达（P<0.05，P<0.01）。PSI 对p65 和c-Jun 在胞浆中的表达水平无显著影响。上述结果提示PSI能够抑制LPS 刺激下NF-κB、IRF3 和c-Jun 的入核，从而下调相关炎症因子的释放。

图4 PSI对LPS刺激的RAW264.7细胞p65、IRF3和c-Jun核转位的影响

4 讨论

本研究采用大孔树脂富集天山雪莲的总酚酸成分，通过UPLC检测发现PSI富含绿原酸，而不含芦丁。绿原酸等酚酸类化合物是植物次生代谢产物，被认为是第七类营养素[19]，具有抗氧化等多种药理活性。绿原酸广泛分布于药用植物中，近年来多项研究表明，绿原酸具有抗炎、调节免疫和改善代谢等作用[20]，是天山雪莲发挥抗炎作用的主要有效成分之一。后续实验将测定PSI 中其他酚酸类成分，并检测其抗炎作用及相关机制，进一步明确其抗炎作用的物质基础，为开发天山雪莲的酚酸类有效成分作为抗炎药物提供药理学依据。

巨噬细胞是体内重要的免疫防御细胞，参与清除机体内微生物病原体和组织碎片，募集中性粒细胞、嗜酸性粒细胞等其他免疫细胞进入炎性组织，共同协助恢复机体免疫平衡。在病理状态下，过度活化的巨噬细胞能够放大炎症反应，引起组织损伤[21]，在肺炎、关节炎[22]、胰腺炎[23]等炎性疾病的发生和发展中起到了重要的作用。在本研究中，笔者采用经典的LPS 诱导的RAW264.7 细胞炎症模型，来探讨PSI 的抗炎作用及作用机制。研究结果表明PSI能有效的抑制LPS诱导的RAW264.7细胞炎症因子的过度释放，提示PSI 能够改善LPS 诱导的炎症反应。因此，结果表明总酚酸类成分是天山雪莲发挥抗炎作用、防治炎性疾病的潜在有效部位之一。

TLR4是免疫应答重要的一员，也是各种急慢性疾病的药物靶点[24-26]。TLR4 含有24 个重复的富含亮氨酸序列，以便促进蛋白与蛋白的相互结合，通过此结构来识别病原体及其产物[27]。激活巨噬细胞中的TLR4 信号能够募集细胞内多种接头蛋白，从而磷酸化激活下游的IKKα/β复合物，后者促进IκBα磷酸化，引起其泛素化降解，释放NF-κB/p65，使得游离在胞浆中的NF-κB/p65 磷酸化活化，从而进入细胞核中，与DNA 结合，促进炎症因子的基因转录[28]。本研究发现，PSI 能显著抑制IKKα/β、IκBα和p65 的磷酸化，并降低p65 的入核，提示PSI 可能通过TLR4/p65 信号通路从而抑制LPS 诱导的RAW264.7 细胞炎症因子的释放。同时，TLR4 信号活化激酶TBK1，使IRF3 磷酸化二聚化并移位到核内，启动趋化因子、Ⅰ型干扰素基因的表达[29]。此外，TLR4信号还可以激活包括ERK1/2、p38和JNK在内MAPKs 蛋白激酶，最终导致激活子蛋白1（AP-1）亚基如c-Fos、c-Jun 等的激活和入核，与DNA 应答元件结合，启动炎症因子相关基因的转录，促进炎症因子的合成及释放[30]。本研究结果显示，PSI 能降低LPS 诱导的TBK1、IRF3、MAPKs和c-Jun 的磷酸化活化，并抑制IRF3 和c-Jun 的入核，表明PSI 也能通过TLR4/IRF3 和TLR4/c-Jun 信号通路抑制LPS 诱导的RAW264.7 细胞炎症因子的产生。

综上所述，本研究在体外水平研究了PSI对LPS诱导的RAW264.7 细胞炎症模型炎症因子释放的影响，揭示了PSI 对TLR4 信号通路的抑制作用可能是其发挥抗炎作用的重要机制。本研究为天山雪莲及其相关制剂防治炎症性疾病的临床应用提供药理学依据，本课题组后续将在动物水平进一步验证PSI治疗炎性疾病的药效，并验证其作用机制。