UPLC指纹图谱结合化学模式识别评价不同产地五灵脂药材质量△

严玉晶，李玲，麦贵敏，曹嵌，林嘉明，邝敏，刘燎原

广东一方制药有限公司 广东省中药配方颗粒企业重点实验室，广东 佛山 528244

五灵脂为鼯鼠科动物复齿鼯鼠Trogopterus xanthipesMilne-Edwar的干燥粪便，始载于《开宝本草》：“出北地，此是寒号虫粪也”[1]。赵佳琛等[2]通过对历代本草文献的考证，确定五灵脂的主流来源为复齿鼯鼠T.xanthipes的干燥粪便，以山西、河北两省太行山一带为五灵脂最主要的产区。《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）1977年版至1990 年版中记载五灵脂为鼯鼠科动物复齿鼯鼠T.xanthipesMilne-Edwar的干燥粪便，根据外形的不同常分为“灵脂块”及“灵脂米”，灵脂米以体轻、色黑棕、断面色黄绿者为佳[3-5]；《中国药典》1995 年版至2020 年版正文中则不再收录。五灵脂主要含有黄酮类、酚酸类、三萜类和核苷类化学成分[6-7]，为活血、散瘀、止痛的中药，主治胸痛、脘腹疼痛、痛经、经闭、产后血瘀疼痛、跌仆损伤、蛇虫咬伤等[8]，在消化性疾病、妇科疾病等方面广泛应用[9]，因此五灵脂在各地方现行药材标准中仍有收录。

目前，五灵脂相关研究主要在临床配伍、药理药效、理化鉴别、含量测定及炮制方面，对其指纹图谱的研究较少。中药成分复杂，仅针对少数几个成分进行研究难以反映药材质量全貌，同时，五灵脂药材为复齿鼯鼠干燥粪便，其质量与复齿鼯鼠食料密切相关，食料不同，所得药材化学成分及药理作用均有一定差异。因此，本研究建立了五灵脂药材超高效液相色谱法（UPLC）指纹图谱，并结合化学模式识别评价不同产地药材质量、筛选出不同产地药材质量差异标志性成分，以期为五灵脂药材质量研究提供参考。

1 材料

1.1 仪器

H-Class 型超高效液相色谱仪（美国Waters 公司）；Milli-Q Direct 型超纯水系统（德国Merck 公司）；111B 型二两装高速中药粉碎机（浙江瑞安市永历制药机械有限公司）；XP26型百万分之一天平、ME204E 型万分之一天平均购于瑞士Mettler-Toledo公司；DLSB-5/20B 型低温冷却液循环泵（郑州长城科工贸有限公司）；HWS-28 型电热恒温水浴锅（上海一恒科技仪器有限公司）。

1.2 试药

五灵脂药材22 批（编号为W1～W22），经广东一方制药有限公司孙冬梅主任中药师鉴定为鼯鼠科动物复齿鼯鼠Trogopterus xanthipesMilne-Edwar 的干燥粪便，药材对应编号及产地见表1。

表1 22批五灵脂药材来源信息

对照品原儿茶酸（批号：110809-201906，纯度：97.7%）、槲皮苷（批号：111538-202007，纯度：93.5%）、4-羟基苯甲酸（批号：101149-201903，纯度：100.0%）、苯甲酸（批号：100419-201703，纯度：99.9%）、穗花杉双黄酮（批号：111902-201603，纯度：97.7%）均购自中国食品药品检定研究院；对照品扁柏双黄酮（成都瑞芬思生物科技有限公司，批号：RFS-B0511808009，纯度：97.00%）；乙腈、磷酸为色谱纯；水为超纯水；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：ACQUITY UPLC HSS T3（150 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脱（0～10 min，6%～16%A；10～16 min，16%～20%A；16～24 min，20%～27%A；24～32 min，27%～39%A；32～38 min，39%～47%A；38～48 min，47%A；48～50 min，47%～90%A；50～52 min，90%A）；柱温：30 ℃；检测波长：265 nm；流速：0.25 mL·min-1；进样量：1.0 μL。

2.2 对照品溶液的制备

取对照品原儿茶酸、4-羟基苯甲酸、苯甲酸、槲皮苷、穗花杉双黄酮、扁柏双黄酮适量，精密称定，加甲醇溶解制成质量浓度分别为28.919、57.900、80.420、26.461、33.023、53.244 μg·mL-1的混合对照品溶液，即得。

2.3 供试品溶液的制备

取五灵脂粉末（过三号筛）约2.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80%乙醇50 mL，称定质量，加热回流60 min，放冷，再称定质量，用80%乙醇补足减失的质量，摇匀，用0.22 μm 微孔滤膜滤过，即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度试验 取五灵脂药材粉末（编号：W13），精密称定，按2.3 项下方法制备供试品溶液，按2.1 项下色谱条件连续测定6 次，以5 号峰苯甲酸为参照峰（S），计算得各共有峰相对保留时间RSD<0.12%、相对峰面积RSD<1.55%，表明仪器精密度良好。

2.4.2 重复性试验 取五灵脂药材粉末（编号：W13），精密称定，按2.3 项下方法平行制备6 份供试品溶液，按2.1项下色谱条件测定，以5号峰苯甲酸为参照峰（S），计算得各共有峰相对保留时间RSD<0.04%、相对峰面积RSD<1.29%，表明该方法重复性良好。

2.4.3 稳定性试验 取五灵脂药材粉末（编号：W13），精密称定，按2.3 项下方法制备供试品溶液，按2.1 项下色谱条件分别在0、2、4、8、12、24 h 进样测定，以5 号峰苯甲酸为参照峰（S），计算得各共有峰相对保留时间RSD<0.17%、相对峰面积RSD<2.67%，表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.5 指纹图谱的建立及分析

2.5.1 指纹图谱的建立及共有峰指认 取22 批五灵脂药材，按2.3项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，记录色谱图。采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”（2012 版）对22 批五灵脂药材色谱图进行处理，以W13 号样品色谱图为参照图谱，时间窗宽度为0.1 min，选用平均数法生成对照指纹图谱R。共标定14 个共有峰，通过对照品比对，指认出其中6 个峰，分别为原儿茶酸（1号峰）、4-羟基苯甲酸（2 号峰）、苯甲酸（5 号峰）、槲皮苷（7 号峰）、穗花杉双黄酮（11 号峰）、扁柏双黄酮（14号峰）。22批五灵脂药材UPLC指纹图谱叠加图、对照指纹图谱R 见图1，混合对照品色谱图、空白试剂色谱图及共有峰指认见图2。

图1 22批五灵脂药材UPLC指纹图谱叠加图及对照指纹图谱R

图2 22批五灵脂药材UPLC指纹图谱共有峰指认

2.5.2 相似度评价 采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”（2012 版）对22 批五灵脂药材进行相似度评价，以对照指纹图谱R 为参照，22 批五灵脂药材相似度为0.870～0.998，相似度评价结果见表2。以5 号峰苯甲酸为参照峰（S），计算22 批五灵脂样品共有峰相对保留时间RSD<1.43%、相对峰面积RSD 为20.31%～123.55%。说明不同产地五灵脂药材各化学组成相似，但样品间共有化学成分的质量分数存在一定差异。

表2 22批五灵脂药材指纹图谱相似度

2.6 化学模式识别分析

2.6.1 聚类热图分析 聚类热图可通过横向与纵向聚类来反映样本的批间差异及成分间的相关性，同时热图色块颜色的深浅能直观地反映成分含量的高低[10]。将22 批五灵脂药材的14 个共有峰单位峰面积进行归一化后，导入Hiplot 科研绘图平台[11]，选择“ward” 聚类方法，行列距离度量为“euclidean”，生成聚类热图。结果如图3 所示，22批不同产地五灵脂药材可聚为两大类，W1～W12 聚为一类，为陕西省商洛市的样品，W13～W22 聚为一类，为陕西省西安市及山西、湖北、河北省的样品。其中样品W13～W22 具有较高相似性，无明显的区域性差异，在该聚类中特征峰7（槲皮苷）、峰9、峰10、峰11（穗花杉双黄酮）、峰13、峰14（扁柏双黄酮）颜色偏暖，表明所含成分含量相对较高，该特征与样品W1～W12 具有明显区分；同时，热图显示特征峰1（原儿茶酸）在不同产地中呈现出明显的区域性特征，陕西省西安市、商洛市所产五灵脂中原儿茶酸含量较低，山西、湖北、河北省样品中原儿茶酸含量较高。由结果可知，通过聚类热图分析，可将陕西省所产五灵脂药材与其余产地进行区分。

图3 22批五灵脂药材UPLC指纹图谱聚类热图

2.6.2 正交偏最小二乘法-判别分析（OPLSDA）OPLS-DA 是一种有监督的判别分析统计方法，近年来，在相关的中药领域常作为生药质量评价、中药炮制前后成分差异研究、中药药理代谢组学及中药潜在质量标志物探索的基础方法之一[12]，通过OPLS-DA 进一步明确不同产地五灵脂药材质量差异成分。将22 批五灵脂药材指纹图谱共有峰的单位峰面积导入SIMCA 14.1 软件，进行OPLS-DA。模型三大指标数据矩阵解释率参数自变量的可解释率（R2X）为0.943、模型区分参数因变量的可解释率（R2Y）为0.961、模型预测参数（Q2）为0.893，表明模型具有良好的解释及预测能力[13]。OPLS-DA模型得分图见图4，显示22 批五灵脂药材共聚为两类，陕西省商洛市各区县乡镇所产五灵脂与其余产地样品分别聚集在坐标轴左右两侧，表明样品成分含量有明显差异，与聚类热图分析结果一致。根据OPLS-DA模型得到14个化学成分的变量重要性投影（VIP）值见图5，以VIP 值>1 为标准，得到不同产地五灵脂药材的质量差异标志性成分，根据影响程度依次为色谱峰9、峰7（槲皮苷）、峰11（穗花杉双黄酮）、峰10、峰1（原儿茶酸）、峰8、峰6，说明以上7 个成分是造成不同产地五灵脂药材质量差异的主要成分。

图4 22批五灵脂药材OPLS-DA得分

图5 22批五灵脂药材OPLS-DA VIP值（,n=22）

3 讨论

3.1 指纹图谱的建立

五灵脂主要化学成分包括黄酮类及酚酸类成分，分别取对照品溶液及供试品溶液进行全波长扫描（190～400 nm），结果显示，原儿茶酸、4-羟基苯甲酸、苯甲酸等酚酸类成分在波长255～260 nm 具有最佳吸收，而槲皮苷、穗花杉双黄酮、扁柏双黄酮等黄酮类成分在波长255～268、348～337 nm 具有最佳吸收，综合考虑最终选择检测波长为265 nm，基线平稳且各色谱峰响应较高。同时，本研究分别对不同的提取方式（超声、回流）、提取时间（15、30、60 min）、提取溶剂（50%乙醇、80%乙醇、乙醇、50%甲醇、80%甲醇、甲醇）、料液比（1∶25、1∶50）、柱温（28、30、32 ℃）及流速（0.23、0.25、0.27 mL·min-1）等进行考察，最终确定上述最佳色谱条件，色谱峰较多、分离效果较好。建立的五灵脂药材UPLC 指纹图谱共标定14 个共有峰，指认出其中6个成分，分别为原儿茶酸、4-羟基苯甲酸、苯甲酸、槲皮苷、穗花杉双黄酮、扁柏双黄酮。该方法专属性、重复性、稳定性良好，可用于五灵脂药材质量控制。

3.2 结果分析

通过五灵脂指纹图谱相似度分析及计算各特征峰相对峰面积RSD，发现不同产地五灵脂药材化学成分相似度较高，但相对峰面积RSD 具有较大差异，推测这可能是复齿鼯鼠的生长环境、喂养食料及五灵脂药材的收集时期等多方面因素共同产生的影响。通过观察各样品特征峰峰面积，黄酮类成分（槲皮苷、穗花杉双黄酮、扁柏双黄酮）所占比例最高，酚酸类成分（苯甲酸、原儿茶酸、4-羟基苯甲酸）次之，两类成分特征峰峰面积之和为总峰面积的68.09%～83.37%。有研究发现，双黄酮类成分对人凝血酶有强烈的抑制作用[14]，以苯甲酸为母核的酚酸类物质可明显抑制血小板凝聚[15]，这与五灵脂活血化瘀、通利血脉的功效具有相关性。同时，临床上五灵脂还用于治疗消化性溃疡、盆腔炎、慢性萎缩性胃炎[16]及多种痛症[17]，与黄酮类、酚酸类成分的抗炎、抗菌、抗病毒、抗肿瘤等功效密切相关。

化学计量学作为一种新兴的分析实验方法，广泛应用于中药鉴别、定性表征、质量控制、组效关系等研究中，尤其在中药的质量控制与评价研究中具有重要意义，通过无监督的模式识别（聚类分析等）获取样本分类信息，再经过有监督的OPLS-DA等方法识别样本间质量差异标志性成分[18]。聚类热图分析表明，22 批五灵脂药材可聚为两类，陕西省商洛市样品可与其他产地进行区分；山西、湖北、河北样品中原儿茶酸及黄酮类成分含量明显高于陕西省样品。通过有监督的OPLS-DA 找出7 个质量差异标志性成分。

笔者查阅文献发现，市场流通的五灵脂药材多为人工饲养鼯鼠生产所得，食料以侧柏叶为主，同时人为地掺杂其他树叶[19]。黄酮类及双黄酮类成分是侧柏叶的特征性成分，也是有效成分，孟丽娟等[20]将杨梅苷、槲皮苷、穗花杉双黄酮和扁柏双黄酮作为侧柏叶的含量控制指标。由此可推测，五灵脂中黄酮类成分来自复齿鼯鼠的主要食料侧柏叶，故该类成分特征峰面积占比最高。笔者研究发现，河北、山西、湖北省及陕西省西安市五灵脂样品中，均检测出杨梅苷、槲皮素成分，而陕西省商洛市所产五灵脂中2 个成分含量较低，甚至无法检出。程明等[19]调查发现，陕西商洛鼯鼠基地人工饲养鼯鼠时除采用侧柏叶外也人为掺杂其他树叶及馒头、奶粉等。刘玉太等[21]经过多年研究总结，指出复齿鼯鼠在繁殖季节需喂养鲜牛奶、玉米面、馒头及多维素和矿物质，以保证营养需求。由此推测复齿鼯鼠主食中侧柏叶的占比是导致五灵脂中黄酮类成分含量变化的原因之一。此外，五灵脂在历代本草中均被记载“采无时”，现代药材标准及文献也认为全年均可采收[2-5,8,21]。处于繁殖季节的复齿鼯鼠以玉米面、馒头为食，其粪便是否与五灵脂具有相同化学成分、功效，有待进一步考察。五灵脂药材虽未被收录于《中国药典》2020 年版正文部分，但其在成方制剂和单味药制剂中仍有14 种中药复方制剂[22]，复齿鼯鼠的规范喂养及五灵脂的固定采收是否更有利于保证五灵脂药材质量和疗效的稳定，有待进一步研究。

综上，本研究建立的五灵脂药材UPLC 指纹图谱及化学模式识别方法可较整体地反映不同产地五灵脂药材的化学成分差异，并筛选出质量差异标志性成分，可为五灵脂药材质量研究提供参考。