基于生物信息学筛选脓毒症中性粒细胞活化的关键基因

陆洲成, 钟树武, 言彩红, 张群峰

南华大学衡阳医学院附属第二医院重症医学科,湖南衡阳 421001

脓毒症为宿主对感染的免疫反应失调引起的危及生命的器官功能障碍,是引起重症监护病房(intensive care unit,ICU)患者死亡的主要原因之一[1-2]。目前,脓毒症的治疗手段主要是抗感染和对症支持治疗,但其特异性疗法仍缺乏[3]。中性粒细胞是一种重要的免疫细胞,位于病原微生物入侵的第一线,对感染的控制起着重要作用[4]。在脓毒症发病的过程中,中性粒细胞积极响应并发挥着抗感染作用,然而,失调和过度活化的中性粒细胞也引起剧烈的炎症反应和严重的组织损伤,导致脓毒症患者预后不良[5]。因此,对中性粒细胞活化的调控是治疗脓毒症的重要方面[6],中性粒细胞活化的关键基因有望成为诊断和治疗脓毒症的生物标志物。本研究通过生物信息学方法,筛选出脓毒症中性粒细胞活化的关键基因,以期为未来脓毒症的早期诊断、预后判断及治疗提供新思路。

1 材料和方法

1.1 数据获取与整理

从GEO数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)下载4个成人脓毒症芯片数据集(GSE69528、GSE28750、GSE57065、GSE95233)及1个儿童脓毒症芯片数据集GSE66099。GSE69528包含83例脓毒症和55例对照样本;GSE28750包含10例脓毒症样本和20例对照样本;GSE57065包含82例脓毒症样本和25例对照样本;GSE95233包含102例脓毒症样本和22例对照样本。GSE66099包含199例脓毒症样本和47例对照样本。所有数据集所取样本为全血样本。

1.2 差异表达基因筛选

采用Perl语言(perl软件v5.32.0版本)合并数据集,采用R语言(R软件3.6.3版本)进行标准化及表达值计算等处理。差异表达基因(differentially expressed gene,DEG)分析使用R语言,采用Fold-change和T-test进行DEG筛选,筛选条件为|logFc|≥1、P<0.05,结果用火山图显示。

1.3 重叠DEG鉴定

采用韦恩图(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny)识别重叠的DEG。

1.4 DEG富集分析

对4个成人数据集重叠DEG进行基因本体论(gene ontology,GO)功能分析,包括生物过程(biological process,BP)、细胞成分(cell composition,CC)和分子功能(molecular function,MF)。

1.5 蛋白互作网络构建

重叠的DEG在STRING数据库网站(https://cn.string-db.org/)中进行多个蛋白质搜索,以预测蛋白互作(protein-protein interaction,PPI)网络,运用Cytoscape软件(https://cytoscape.org/)将PPI网络结果可视化并进行模块分析,使用Ctyohubba插件MCC算法提取PPI网络中枢纽基因即为关键基因。

1.6 关键基因诊断价值的鉴定

通过ROC曲线下面积(area under the curve,AUC)确定关键基因对脓毒症的诊断价值。

1.7 免疫浸润分析

采用CIBERSORT算法评估22个免疫细胞比例,分析各数据集脓毒症组与对照组之间的免疫细胞分布。Wilcoxon秩和检验比较免疫细胞在两组中的表达差异。P<0.05为差异具有统计学意义。

1.8 外部数据集验证

通过儿童脓毒症芯片数据集GSE66099 199例脓毒症和47例对照组全血样本进行关键基因表达的验证,以同样的生物信息分析方法进行分析。

2 结 果

2.1 脓毒症重叠DEG筛选及GO富集分析

GSE69528、GSE95233、GSE57065、GSE28750数据集分别筛选出1 328、986、789、824个DEG,得到重叠DEG 299个(图1A),其中上调112个,下调187个。重叠DEG的PPI可视化见图1B。GO富集结果显示,BP主要富集于中性粒细胞活化、中性粒细胞脱颗粒等;MF主要富集于肽酶调节活性、糖胺聚糖结合等;CC主要富集于特殊颗粒、囊泡腔等(图1C)。

图1 脓毒症的重叠DEG筛选及GO富集分析结果A为DEG韦恩图;B为DEG的PPI网络图(蓝色为下调基因、红色为上调基因);C为DEG的GO富集分析气泡图。

2.2 脓毒症中性粒细胞活化的关键基因

与中性粒细胞活化相关的DEG共55个(图2A)。55个候选DEG中的49个DEG被筛选进入到DEG PPI网络复合体中,PPI可视化见图2B;进一步筛选出前10位枢纽基因作为脓毒症中性粒细胞活化相关的关键基因,分别为MPO、CTSG、ELANE、MMP9、LCN2、MMP8、LTF、CAMP、S100A12、DEFA4。

2.3 中性粒细胞活化的关键基因的表达水平及诊断价值

10个关键基因在4个成人数据集的脓毒症样本组中均上调(P<0.05);ROC AUC均大于0.7(图3),提示具有较好的诊断价值。

2.4 脓毒症数据集免疫细胞的差异分析

成人脓毒症患者全血样本中单核细胞、中性粒细胞、M0巨噬细胞均上调,其中以中性粒细胞上调最为显著(图4;P<0.05)。

图4 4个成人数据集脓毒症患者与对照组全血样本免疫细胞的差异分析a为P<0.05,与对照组比较。

2.5 关键基因的验证

采用儿童脓毒症芯片数据集GSE66099进行验证,筛选到1 143个DEG,其中上调562个,下调581个(图5A)。GO富集分析的BP、CC、MF结果验证了成人脓毒症数据集的富集结果(图5B)。筛选出与中性粒细胞活化相关的125个DEG(图5C)和10个关键基因(图5D),其中8个与成人脓毒症数据集中筛选出的关键基因相同。成人的10个关键基因在儿童脓毒症全血样本表达上调(P<0.05;图5E),ROC AUC均大于0.7,验证关键基因对儿童脓毒症亦有较好的诊断价值(图5E)。儿童脓毒症数据集免疫细胞的差异分析提示中性粒细胞上调最为显著(图5F;P<0.05),与成人脓毒症数据集中的趋势一致。

3 讨 论

脓毒症早期阶段,局部感染未得以有效控制,导致固有免疫细胞的过度活化,最终爆发细胞因子风暴;在后期,因早期免疫细胞的过度活化,大量免疫细胞损伤或死亡,使免疫抑制持续、免疫功能低下,最终导致继发严重感染或脓毒症的复发[7]。在脓毒症中,中性粒细胞参与抗感染、炎症诱导、组织病理损伤,合并出现功能障碍和迁移功能异常[8]。本文GO分析结果证实中性粒细胞活化是脓毒症发生发展中的关键环节,也显示了其可能的相关通路以及生物学过程,主要包括中性粒细胞激活、中性粒细胞脱颗粒、参与免疫反应的中性粒细胞活化、中性粒细胞介导的免疫;提示中性粒细胞活化是脓毒症发生发展的重要分子生物学过程。鉴定筛选脓毒症中性粒细胞活化关键基因,将为脓毒症的早期诊断、治疗干预的靶点选择提供新线索。

本研究筛选出脓毒症中性粒细胞活化相关的前10位枢纽基因为关键基因,分别为S100A12、CTSG、MPO、MMP9、MMP8、LCN2、ELANE、LTF、CAMP、DEFA4。S100A12、CTSG被报道由中性粒细胞分泌[9-10]。S100A12是S100亚家族中的一种蛋白,该蛋白被认为参与特定的钙依赖性信号转导途径,在感染性疾病中发挥重要的生物学作用。S100A12在新生儿败血症中显著升高,可被视为其新的生物标志物。在脓毒症诱导的急性呼吸窘迫综合征(aute respiratory distress syndrome,ARDS)中,S100A12可通过激活NLRP3胞质体信号促进脓毒症诱导的ARDS中的炎症和细胞凋亡,S100A12可能是脓毒症诱发的ARDS临床诊断中肺损伤的有关生物标志物[11]。CTSG可修饰趋化因子、细胞因子和细胞表面受体而在炎症和免疫反应中发挥重要作用,还能消灭中性粒细胞内外病原体[12],GTSG在脓毒症中暂未有研究报道,但有着潜在的研究价值。MPO是中性粒细胞激活的标志,在炎症反应的调节中发挥关键作用[13]。在Törnblom等[14]的一项研究中发现中性粒细胞活化标志物MPO,MPO的升高是脓毒症演变的早期事件,持续时间超过促炎细胞因子白细胞介素(interleukin,IL)-6、IL-8反应消退的时间,不易受到采样时间影响,未来可能作为早期脓毒症诊断的可靠指标。Bonaventura等[15]研究结果表明MPO升高可提示中性粒细胞的早期过度激活并提示预后不良。ELANE是丝氨酸蛋白酶的一个亚家族,水解专门的中性粒细胞溶酶体中的蛋白质、嗜蓝粒细胞颗粒以及细胞外基质。研究报道人类嗜中性粒细胞释放ELANE选择性杀死多种癌细胞[16]。研究发现,ELANE相关的中性粒细胞减少与感染密切相关[17]。在Gu等[18]的研究中,发现在体外miR-608结合ELANE mRNA编码区的靶位点,并抑制其在人单核细胞中的表达,可能是诊断或治疗脓毒症的新靶点。MMP9可以保护中性粒细胞弹性蛋白酶活性,还能从IL-8上分解一个62氨基酸肽,使其向中性粒细胞的趋化活性增加10倍,这种酶可能通过IV型胶原和弹性蛋白的蛋白水解在退行性和炎症性疾病中发挥作用[19]。研究显示MMP9在脓毒症患者中上调[20-21],提示MMP9未来可能作为脓毒症的一个潜在治疗靶点。MMP8也被报道在脓毒症中上调,与其预后不良和介导白细胞黏附相关[22]。LTF存在于中性粒细胞的特定颗粒中,LTF水平升高可能是中性粒细胞活化的标志。在Anderson等[23]的研究中,与其他病理相比,脓毒症组中LTF的水平升高。LCN2可作为脓毒症相关的ARDS、肾损伤及脑功能障碍的生物标志物[24-25]。在LPS诱导的败血症模型中,LCN2敲除小鼠表现出铁代谢失调,白细胞凋亡,促炎细胞因子释放和死亡率增加[26]。DEFA4是由DEFA4基因编码的人类防御素肽,在中性粒细胞颗粒中表达,可保护宿主免受细菌和病毒的侵害[27]。以上研究结果支持了本次生物信息学的筛选结果。

综上所述,本研究筛选出脓毒症中性粒细胞活化相关的关键基因10个,并进行了验证。10个关键基因可能参与中性粒细胞活化的多个信号途径,从而在脓毒症的发病过程中起重要作用;为未来脓毒症的早期诊断、预后判断及治疗提供新思路。