分子印迹电化学发光传感检测预制菜中的恩诺沙星

摘 要： 本文基于石墨相氮化碳纳米片（g-C3N4 NSs）和分子印迹聚合物制备了一种分子印迹电化学发光（MIP-ECL）传感器用于特异性检测恩诺沙星（ENR）。采用出色电化学发光性能的g-C3N4 NSs作为发光体，以ENR为模板分子，邻苯二胺为功能单体，在修饰电极表面通过循环伏安法制备分子印迹聚合物膜。在最优条件下，该MIP-ECL传感器对ENR的线性响应范围为5×10−9～1×10−5 mol/L，最低检出限为9.6×10−10 mol/L。此外，传感器在实际样品中加标回收率为98.30%～106.20%。研究表明，该传感器具有成本低、灵敏度高、选择性好等优点，非常适合用于预制菜等食品中恩诺沙星的快速筛查。

关键词： 电化学发光；分子印迹聚合物；恩诺沙星；石墨相氮化碳纳米片；预制菜

中图法分类号： O657.1 文献标识码： A 文章编号： 1000-2324（2024）06-0961-07

预制菜是以一种或多种农产品为主要原料，运用标准化流水作业，经预加工（如分切、搅拌、腌制、滚揉、成型、调味等）或预烹调（如炒、炸、烤、煮、蒸等）制成，并进行预包装的成品或半成品菜肴［1］。在预制菜生产过程中，农兽药残留物、食源性致病菌、环境污染物是危害公众健康的重要因素。恩诺沙星（ENR）作为一种广谱氟喹诺酮类抗生素，因其良好的抗菌效果被广泛用于畜禽养殖领域［2］，导致其在动物源性食品，尤其是禽肉预制菜中残留，对人类健康造成威胁［3-5］。许多国家和组织明确了ENR在不同动物产品中的最大残留限量标准。中国农业部和欧盟委员会规定，ENR 在动物组织中的最大残留限量为0.1 mg/kg［6］。为保障人类健康，对食品中ENR的含量进行快速筛查至关重要。目前已经报道了多种检测ENR 的方法，包括高效液相色谱法（HPLC）［7］、液相色谱串联质谱法（LCMS）［8］、毛细管电泳法（CE）［9］和酶联免疫吸附法（ELISA）［10］等，这些方法存在价格昂贵、耗费时间长、成本高等不足。因此，开发一种成本低、操作简单的ENR检测新方法至关重要。

近年来，电化学发光（ECL）因其具有优越的可控性、低背景噪声、高灵敏度等特点而备受关注［11，12］。然而，食品中复杂基质容易造成干扰而影响测定结果［13］。分子印迹聚合物（MIP）具有高选择性、稳定性、可重复使用性等优点［14］，是一种理想的识别元件。因此，将分子印迹技术与ECL相结合有望实现ENR的高灵敏、准确检测。

本文以具有出色ECL性能的石墨相氮化碳纳米片（g-C3N4 NSs）作为ECL 信号探针。以ENR为模板分子，邻苯二胺（O-PD）为功能单体，在修饰电极表面电聚合制备MIP膜，该膜能够特异性识别ENR。基于此，研发了一种选择性好、灵敏度高的MIP-ECL 传感器，实现了预制菜中痕量ENR的快速检测。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

过硫酸钾（K2S2O8）购于上海沃凯生物技术有限公司；石墨相氮化碳（g-C3N4）购于江苏先丰纳米材料科技有限公司；恩诺沙星（ENR）和邻苯二胺均购于上海麦克林生化科技有限公司；磷酸盐缓冲液是由磷酸二氢钠和磷酸氢二钠配制而成。所有药品均为分析纯，溶液以超纯水配置。预制菜样品（无骨鸡柳、雪花鸡柳和小酥肉）购于泰安永辉超市。

电化学工作站（上海辰华仪器有限公司）；MPI-E 型电化学发光分析仪（西安瑞迈分析仪器有限公司）。

1.2 MIP/g-C3N4 NSs/GCE的制备

将玻碳电极（GCE）用0.5 μm 和0.03 μm 的Al2O3进行抛光处理，然后用无水乙醇、去离子水分别超声5 min，晾干。随后，将8 μL g-C3N4 NSs溶液（参照文献［15］方法合成）滴涂到GCE 表面，晾干，得到g-C3N4 NSs/GCE 电极。将得到的电极置于一定浓度比例的ENR 和邻苯二胺的0.1 mol/L HAc-NaAc 缓冲溶液中（pH=5.2），CV法在0 ～ 0.8 V电压范围内，以50 mV/s 的扫描速率连续扫描若干圈。最后，将修饰电极浸入0.1 mol/L NaOH的乙醇和水（V/V=3∶1）溶液中，磁力搅拌一段时间除去模板分子，晾干，得到MIP/g-C3N4 NSs/GCE工作电极。

1.3 MIP-ECL传感检测方法

ECL 测试和电化学分析均采用传统的三电极体系。MIP/g-C3N4 NSs/GCE为工作电极，铂丝电极为辅助电极，Ag/AgCl 电极为参比电极。将洗脱后的MIP/g-C3N4 NSs/GCE 工作电极浸入到不同浓度的ENR的溶液中孵育14 min。然后，将洗脱后的MIP/g-C3N4 NSs/GCE和孵育后的MIP/g-C3N4 NSs/GCE 分别置于含有0.1 mol/L K2S2O8的PBS（pH=7.4）检测底液中，在电压为0～−1.2 V范围内，以100 mV/s 扫描速率、−600 V光电倍增压进行ECL 测试，记录相应的ECL 信号差值ΔECL（ΔECL=F0−F，F0为模板分子洗脱后传感器的ECL信号，F为目标物孵育后的ECL信号）。

1.4 实际样品检测

为了评价MIP-ECL 传感器检测实际样品的性能，采用标准加入法测定无骨鸡柳样品中ENR 的回收率。样品制备流程：准确称取无骨鸡柳样品5 g，加入不同浓度的ENR 标准溶液，孵育24 h 后，加20 mL酸化乙腈溶液，无水硫酸钠10 g，高速均质，离心，将得到的上清液置于分液漏斗中。用酸化乙腈溶液20 mL溶解下层沉淀，重复提取2 次，合并得到的上清液。随后，在分液漏斗加入60 mL 乙腈饱和正己烷溶液，振荡、静置，待分层后取乙腈层旋蒸至干。最后，用5 mL PBS 复溶，0.22 μm 微孔滤膜过滤后测定ENR含量。

雪花鸡柳和小酥肉样品的制备流程除不添加ENR标准溶液孵育外，其余步骤同上。

2 结果与讨论

2.1 MIP-ECL传感器表征

采用电化学阻抗谱（EIS）法和ECL 法表征不同修饰电极。如图1A所示，EIS图中的半圆对应的是电子传递电阻（Rct），半圆半径与Rct 呈正相关。与裸GCE（曲线a）相比，g-C3N4 NSs/GCE的Rct 略有增加（曲线b）。当电聚合MIP 膜后，Rct 显著增加，这是由于MIP 膜不导电（曲线c）。模板分子洗脱后，形成了许多印迹空腔，促进电子转移，导致Rct 下降（曲线d）。重新孵育模板分子后（曲线e），印迹空腔被堵住，阻碍电子转移，Rct再次增加。

研究了不同修饰电极的ECL响应信号，结果如图1B 所示，裸GCE 没有明显的ECL 信号（曲线a）。电极被g-C3N4 NSs修饰后，其ECL信号明显高于裸GCE（曲线b）。当MIP膜电聚合到电极表面后，传感器的ECL信号明显降低（曲线c），这可能是因为印迹膜阻碍了电子转移。洗脱去除模板分子后，ECL信号明显恢复（曲线d），这是因为洗脱后产生印迹空腔，促进电子转移。重新孵育模板分子后，ECL 信号显著降低（曲线e）。以上结果证明MIP-ECL传感器成功构建。

2.2 MIP-ECL传感器构建条件的优化

为了改善MIP-ECL 传感器的检测性能，获得稳定、准确的ECL响应，我们对不同的实验条件进行了优化。

2.2.1 检测底液的pH 值优化 从图2A 可以看出，随着pH值的增加，ECL响应信号先升高后降低。当pH值为7.4 时，ECL信号达到最大。这可能是由于在较低pH 值下，质子在负电位易被还原，阻碍对g-C3N4 NSs 的还原。而在较高的pH值下，溶液中的OH−会与共反应剂的还原物质SO*− 4 发生反应，消耗SO*− 4 ，导致ECL 响应信号降低。因此，最佳pH值为7.4。

2.2.2 功能单体与模板分子的比例优化 从图2B可以看出，ECL 猝灭值随着模板分子与功能单体比例的改变而变化，当比例为1∶5 时，ECL猝灭值达到最大。这可能是由于功能单体浓度过高时，形成的聚合物交联程度大，从而造成对模板分子的识别能力降低。功能单体浓度过低时，产生的印迹识别位点少，也会造成对模板分子的识别能力降低。因此，选择1∶5 为最佳功能单体与模板分子的比例。

2.2.3 聚合圈数优化 从图2C 可以看出，ECL猝灭值在扫描5 圈时最大。随着扫描圈数的增多，ECL 猝灭值逐渐减小。这可能因为扫描周期变长，导致电聚合形成的印迹膜较厚，会阻碍电子转移。因此，电聚合的最佳聚合圈数为5 圈。

2.2.4 模板分子的洗脱时间优化 洗脱时间是形成印迹空腔的重要条件。如图2D所示，随着洗脱时间的增加，ECL信号逐渐增强。洗脱16 min后，ECL信号基本保持不变，说明模板分子完全被去除。因此，模板分子的最佳洗脱时间为16 min。

2.2.5 孵育时间优化 孵育时间也是影响传感器性能的关键因素。如图2E 所示，随着孵育时间的增加，ECL信号呈现逐渐降低的趋势，当孵育时间达到14 min后，ECL信号基本保持不变。因此，确定最佳孵育时间为14 min。

2.3 MIP-ECL传感检测方法的建立

如图3A所示，随着ENR浓度的增加ECL信号逐渐减小。在最优条件下，ECL 信号差值与ENR 浓度（5×10−9～1×10−5 mol/L）之间具有良好的线性关系（图3B）。线性回归方程为ΔECL=2 089 lg CENR+19 552，相关系数R2 为0.994 8。经计算该传感方法的最低检出限（LOD）为9.6×10−10 mol/L（S/N=3）。表1 是本方法与其他检测ENR 方法的比较。由此可知，与其他方法相比，本方法具有较宽的线性范围和较低的检出限。

2.4 MIP-ECL 传感器的选择性、重现性和稳定性

为了评价MIP-ECL 传感器的选择性，我们选择结构类似物氧氟沙星（OFLX）、诺氟沙星（NOR）、培氟沙星（PFLX）和依诺沙星（ENX）进行ECL 测定。如图4A、4B 所示，该传感器对ENR 有明显的猝灭，但对其他结构类物没有明显的响应，证明传感器对ENR 具有良好的选择性。

此外，我们还对MIP-ECL 传感器的重现性和稳定性进行了评价。如图4C、4D所示，测定了相同条件下6 根MIP/g-C3N4 NSs/GCE 的ECL响应，ECL 强度的相对标准偏差（RSD）低于1.2%，证明该传感器重现性良好。由图4E、4F可知，同一根MIP/g-C3N4 NSs/GCE 4°C下保存四周后，ECL响应依然保持原始ECL响应的96%，证明该传感器具有优异的稳定性。图4G 可以看出，MIP/g-C3N4 NSs/GCE 连续扫描续15 个循环的ECL 强度变化不明显（RSD 为1.5%），说明该传感器具有良好的稳定性。

2.5 实际样品检测

为了考察该传感器的实用性和可行性，将该方法用于无骨鸡柳中ENR的测定。如表2 所示，加标回收率为98.30%～106.20%。

此外，将该方法用于雪花鸡柳和小酥肉中ENR含量的测定，同时采用高效液相色谱法验证分析结果的准确性。如表3 所示，雪花鸡柳和小酥肉中均检测出ENR。虽然残留量小，但是其对人类健康和环境的危害是不可忽视的。因此，需要加强对抗生素的监管。通过计算可知两种方法的检测结果无显著差异，说明MIP-ECL传感器对预制菜中ENR的检测具有较好的准确性。

3 结论

本文基于g-C3N4 NSs优良发光性能和分子印迹聚合物的特异性识别研发了一种MIP-ECL 传感器，其中，g-C3N4 NSs 作为发光材料，分子印迹聚合物作为识别原件，检出限为9.6×10−10 mol/L，添加回收率在98.30%～106.20%之间。该传感器具有良好的选择性、稳定性，较高的灵敏度和实际应用性。该研究为食品或预制菜中ENR的快速筛查提供了新思路。

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