可视化辅助双碳点比率荧光检测水中银离子

韩 雍，马艳鑫，汪 慧，王 雅

（1.陇东学院 农林科技学院，甘肃 庆阳 745000；2.兰州理工大学 生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730050）

重金属离子污染对生态环境和人类健康造成了严重影响。银（Ag）是一种天然重金属，主要以游离态存在于含银矿石中，广泛应用于化学、化学工程、摄影、珠宝、医药和电子电气设备等领域［1］。因银和银基化合物在工业和日常生活中的广泛使用而产生的大量银离子（Ag+）废液，加剧了环境污染。在生态系统中，Ag+通过食物链或直接通过饮用水进入人体，进而在人体内聚积，并导致严重的健康问题［2-3］。银可破坏酶的活性并与各种代谢物结合，最终导致细胞毒性、器官衰竭和线粒体功能下降，其在人体内的蓄积可能会对人体健康造成严重的负面影响［4-5］。现有Ag+的检测方法，如电化学法、电感耦合等离子体质谱法、原子吸收光谱法、中子活化分析法和X 射线荧光法等［6-7］，存在操作复杂、灵敏度低、成本高、对仪器设备精度和操作人员专业性要求高等局限。因此，开发高灵敏、高效便捷的分析方法准确检测Ag+，对监测重金属污染，保障人体健康具有重要意义。

光谱检测法具有便捷高效的优势，以半导体量子点（QDs）为基础的荧光检测方法显示出良好的应用前景。碳点（CDs）作为一种新型有机量子荧光材料，因具有绿色合成、毒性低、生物相容性和水溶性好、稳定性高等优越性能而得到广泛关注，是传统有机染料和半导体量子点的替代物之一［8］。CDs凭借优良的荧光性质，在生物成像［9］、分析检测［10］、催化［11］、纳米医学［12］、光电设备［13］等方面广泛应用。由于检测体系因素复杂，单发射CDs 荧光较难实现满意检测，而具有自校准特性的比率荧光探针因实时响应快、分辨率高、灵敏度高、具有较强的干扰能力而得到广泛关注［14］。比率荧光探针是利用同一激发波长下两个荧光发射峰的强度比进行检测，可以限制内置背景干扰，提高信噪比，进而提高检测灵敏度和准确性［15］。大多数用于Ag+检测的荧光响应均基于单一的荧光探针，易受传感器浓度变化、光源或检测器漂移及复杂样品中的环境等因素的影响［16］，而比率荧光传感器可以避免这些问题。因此构建一种性能优异的比率荧光传感器，并结合一些便携设备用于环境水样中Ag+的定量和可视化半定量检测具有重大意义。

本工作构建了一种用于Ag+检测的简便、快速、灵敏、便携和可靠的可视化比率荧光传感器。首先通过水热法分别以柠檬酸、L-半胱氨酸（L-Cys）和邻苯二胺（OPD）为前体合成了蓝光碳点（B-CDs）和黄光碳点（Y-CDs），随后通过杂化使其形成双碳点（d-CDs）。d-CDs 的荧光光谱在370 nm 下激发时产生420 nm 和560 nm 两处发射峰，向该d-CDs 传感器加入Ag+时分别能够引起这两处发射波长荧光强度的减弱和增强，为实现可视化半定量检测环境水样中Ag+的残留量提供了理论依据。通过对d-CDs 的形貌、官能团和光学特性进行表征，分析了d-CDs对Ag+的荧光响应机制。并考察了d-CDs在环境水样中对Ag+的检测能力。

1 实验部分

1.1 材料与试剂

柠檬酸、L-半胱氨酸（L-Cys）、邻苯二胺（OPD）（上海阿拉丁化学试剂有限公司）；硝酸银（AgNO3）、氯化钾（KCl）、硫酸铜（CuSO4）、硫酸铁（Fe2（SO4）3）、硫酸亚铁（FeSO4）、氯化钴（CoCl2）、硫酸铅（PbSO4）、碳酸钙（CaCO3）、硫酸镁（MgSO4）、硝酸铝（Al（NO3）3）、硫酸锌（ZnSO4）、氯化钠（NaCl）（天津市盛奥化学试剂有限公司）；乙醇、甲醇、丙酮、硼酸（天津市天力化学试剂有限公司）；磷酸（烟台市双双化工有限公司）；冰乙酸、氢氧化钠（天津市大茂化学试剂厂）；二氯甲烷（上海麦克林生化科技股份有限公司）；石油醚（天津市富宇精细化工有限公司）；三氯甲烷（白银良友化学试剂有限公司）。以上试剂均为分析纯，实验用水为超纯水。

1.2 仪器与设备

Talos F200S 透射电子显微镜（TEM，美国FEI 公司）；UV2300II 紫外-可见分光光度计（UV-Vis，上海天美科学仪器有限公司）；D8 X 射线衍射仪（XRD，德国Bruker AXS 公司）；ESCALAB 250Xi X 射线光电子能谱（XPS）、Nicolet iS20 傅里叶变换红外光谱仪（FTIR）（美国Thermo Scientific 公司）；F97pro 荧光分光光度计（上海棱光技术有限公司）；ST2100 pH计（常州奥豪斯仪器有限公司）；KH5200DE超声仪（昆山禾创超声仪器有限公司）和H1850离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）。

1.3 B-CDs的制备

参考文献方法制备蓝光碳点（B-CDs）［17］：称取1 g 柠檬酸和0.5 gL-Cys 于40 mL 超纯水中混合，超声使其完全溶解。将均质溶液转移到50 mL 的四氟乙烯衬里反应器中，于180 ℃下反应2 h。室温自然冷却后，8 000 r/min 下离心15 min，将所得上清液用0.22 µm 微滤膜过滤，得到浅黄色B-CDs 溶液，于4 ℃条件下储存，备用。

1.4 Y-CDs的制备

黄光碳点（Y-CDs）的合成参考文献［18］并进行适当改进：将1 g OPD 溶于40 mL超纯水中，超声分散均匀。随后将溶液置入高压反应釜中，于180 ℃下反应4 h。冷却至室温后，8 000 r/min 下离心15 min除去沉淀物，用0.22 µm微滤膜过滤，滤液于4 ℃冰箱中储存，用于后续实验。

1.5 比率荧光传感器的构建

将制备的B-CDs 与Y-CDs 分别稀释500 倍和10 倍后按溶液体积比3∶1 的比例混合形成双碳点（d-CDs），该d-CDs 的荧光光谱在370 nm 下激发时产生560 nm 和420 nm 两处发射峰，此时荧光强度的比值为IF560∶IF420=1.8∶1。在2 mL pH 7.0 的Britton-Robinson（BR）缓冲液体系中，添加1 mL 不同浓度的Ag+标准溶液与1 mL 的d-CDs，室温孵育45 min 后，于370 nm 激发波长下进行荧光测量并记录B-CDs和Y-CDs的荧光强度（分别为IF420和IF560）。以Ag+标准溶液的梯度浓度为横坐标，d-CDs的荧光比率IF560/IF420为纵坐标，绘制标准曲线。检出限（LOD）由LOD=3ε/σ（ε与σ分别代表空白信号的标准偏差（n＞6）和标准曲线的斜率）进行计算。所有测量均进行3次平行实验。

1.6 选择性评价

为研究该传感器对其他金属离子的抗干扰能力，分别向传感器溶液中加入干扰离子Al3+、Co2+、Ca2+、Fe2+、Cu2+、Fe3+、K+、Mg2+、Na+、Pb2+和Zn2+，并记录荧光强度比值IF560/IF420的变化。

1.7 实际样品检测

为了评估比率荧光传感器在实际样品检测中的可行性和实用性，选择湖水、自来水和矿泉水作为实际样品，经过滤净化后，向实际样品中分别加入不同浓度的Ag+标准溶液并测量相应的荧光强度。

2 结果与讨论

2.1 形貌表征

采用TEM 对所合成的双碳点d-CDs进行微观结构研究，图1A、B分别为d-CDs的TEM 图像和粒径分布图。由图1A 可知，d-CDs 呈球形，分散性好且分布均匀。图1B 所示的粒径范围为0.63～3.52 nm，平均粒径为2.14 nm。通过FTIR研究d-CDs的官能团结构，由图1C分析可知，这些特征峰分别由O—H 的伸缩振动（3 368～3 204 cm-1），2 920、614 cm-1处C—H 的伸缩振动，2 585 cm-1处—SH，1 703、1 385 cm-1处C=O 的非对称和对称伸缩振动，1 497 cm-1处C—N 的弯曲振动，1 555 cm-1处苯环C=C的骨架振动，1 197 cm-1处C—O 的伸缩振动，829 cm-1处—NH2和743 cm-1处C—S 的拉伸振动所引起。上述结果表明d-CDs 中存在芳香族化合物的结构及亲水性基团。图1D 为d-CDs 的XRD 图像，其在23.56°处出现较宽的衍射峰，说明d-CDs 具有无定形结构。另外出现的杂峰表明合成的碳点可能掺杂了其他杂质。

图1 d-CDs的TEM图像（A）、粒径分布图（B）、红外谱图（C）及XRD谱图（D）Fig.1 TEM image（A），diameter size distribution curve（B），FTIR spectrum（C），XRD pattern（D） of d-CDs

通过XPS 进一步对d-CDs 的元素进行分析，图2A 中以291.4、405.31、540.59 eV 为代表的特征峰，分别对应C、N 和O 三种元素。其中C1s 的高分辨光谱（图2B）中显示有3 个键 C—C/C=C（284.8 eV）、C—N/C—S（286.0 eV）和O—C=O（288.7 eV）；N1s的高分辨光谱（图2C）中显示两种不同化学态的N，吡啶N（399.1 eV）和吡咯N（400.4 eV）；O1s 的高分辨光谱（图2D）中显示两个O—C 键：C—O（531. 7 eV）、O—C（531. 9 eV）和一个C=O 键（533. 1 eV）。通过XPS 未能检测出—SH，分析可能是—SH被氧化所致。XPS和FTIR图谱结果说明所合成的d-CDs含有巯基和芳香环结构，另外大量羟基和羧基的存在使得d-CDs具有较好的水溶性。

图2 d-CDs的XPS图谱Fig.2 XPS spectra of d-CDs

2.2 光学性质

Ag+的紫外吸收光谱和d-CDs的荧光光谱图如图3A所示。由图可知，Ag+在220 nm处有一个较强的吸收峰。另外在370 nm波长激发下，d-CDs分别在420 nm和560 nm处产生两个发射峰。d-CDs溶液在日光灯下呈淡黄色，在紫外灯照射下发蓝色荧光（图3A 插图）。图3B 为d-CDs 在不同激发波长下的荧光光谱，激发波长在350～380 nm 范围内变化时，420 nm 和560 nm 处的荧光强度随着激发波长的增大分别呈现下降和增加的趋势，但发射波长未发生位移。为更好地实现Ag+的可视化比率荧光检测，选择370 nm作为最适激发波长。

图3 Ag+的紫外吸收光谱图和 d-CDs的荧光光谱图（A）及d-CDs 在不同激发波长下的荧光光谱（B）Fig.3 Absorbance spectrum of Ag+ and fluorescence spectrum of d-CDs（A） and fluorescent spectra of d-CDs excited at varying wavelengths（B）

2.3 检测条件优化

为了提高所构建的d-CDs 比率荧光传感器检测Ag+的灵敏度，对pH 值、反应温度和孵育时间进行了优化。

考察了不同pH 值（4.0～10.0）的BR 溶液对Ag+加入前后d-CDs 传感器体系的影响。如图4A 所示，在未加入Ag+时，pH 值的变化对荧光强度比值IF560/IF420几乎无影响。加入Ag+并混匀孵育一段时间后发现，pH 4.0～6.0 范围即酸性环境下，IF560/IF420先大幅度增加后趋于缓慢增加；在pH 6.0～7.0 范围内，IF560/IF420显著增加，并在pH 7.0 处达到最大荧光强度值，此时荧光强度具有较好的稳定性，故选择pH 7.0作为体系的最适pH值用于后续实验。

图4 检测条件的优化Fig.4 Optimizations of testing conditions

优化了d-CDs传感器检测Ag+的温度（20、25、30、35、40、45 ℃）和孵育时间（0～85 min）。结果显示，温度对于荧光强度的影响不明显（图4B）。选择0～85 min的孵育时间进行分析，结果如图4C 所示，加入Ag+后，传感器的IF560/IF420在0～45 min 之间急剧增加，45 min 后缓慢增加。表明起初随着Ag+的加入，Ag+能够快速与d-CDs传感器体系表面的官能团结合，使荧光强度比值IF560/IF420增加，随着Ag+与d-CDs 传感器体系的逐渐接触，d-CDs 传感器对Ag+的检测能力下降，导致IF560/IF420增加缓慢并趋于稳定。因此分别选择室温和45 min作为最适反应温度和孵育时间进行后续实验。

2.4 传感器构建

为了探究该传感器检测Ag+的灵敏度，在最佳检测条件下向所构建的d-CDs比率荧光传感器中加入不同浓度的Ag+（0～40 µmol/L），分析其响应程度。结果如图5 所示，随着Ag+浓度的逐渐增加，体系在420 nm 处的荧光强度减弱，而在560 nm 处的荧光增强，荧光强度比值IF560/IF420与Ag+的浓度在0～40µmol/L 范围内呈良好的线性关系，线性回归方程为y=0.004 04x+0.610 37，相关系数（r2）为0.996 7。由LOD=3ε/σ计算得到LOD为1.26 µmol/L。另外通过紫外灯照射，可以实现Ag+的可视化半定量检测（图5 插图）。与其他已报道的检测方法相比［19-23］（表1），本方法的LOD 并非最低，但本文所使用的碳点合成方法具有工艺简单、原料低廉和操作方便等优势，且可通过紫外灯照射实现Ag+的可视化半定量测定。

表1 不同荧光传感器检测银离子对比Table 1 Comparison of different fluorescence sensors for Ag+ detection

图5 d-CDs在不同浓度Ag+（0～40 µmol/L）中的荧光光谱图Fig.5 Fluorescence spectra of d-CDs at different concentrations of Ag+（0-40 µmol/L）

2.5 选择性评价

为了评估本研究所构建的d-CDs比率荧光传感检测方法的特异性，以浓度为1 mmol/L 的其他干扰离子Al3+、Co2+、Ca2+、Fe2+、Cu2+、Fe3+、K+、Mg2+、Na+、Pb2+、Zn2+进行选择性评价。在最优实验条件下，向体系中加入1 mL 10 µmol/L Ag+和上述干扰离子，孵育45 min。结果如图6 所示，在高倍浓度（100 倍）干扰离子存在时，该传感器对干扰离子几乎无响应，而对Ag+响应较明显，表现出良好的选择性。

图6 d-CDs对不同离子的响应情况Fig.6 Response of d-CDs to different metal ions

2.6 d-CDs对Ag+的响应机理

FTIR 和XPS 分析结果表明，d-CDs 表面含有巯基基团、芳香环结构以及大量的羟基和羧基，金属离子能够与这些官能团结合形成复杂的网络结构进而引起d-CDs 溶液的荧光猝灭。结合Ag+的紫外吸收峰与d-CDs的荧光光谱图进行分析，推断荧光共振能量转移（FRET）和内滤作用（IFE）不是d-CDs识别Ag+的主要原因。在370 nm 激发下，体系中加入Ag+会引起d-CDs在420 nm 和560 nm 处的发射峰强度分别减弱和增强，表明Ag+在不同发射峰处的响应机理不同。Ag+能与d-CDs 表面含有的羟基、羧基发生官能团配位形成d-CDs/Ag+复合物，可能通过光致能量转移（PET）猝灭d-CDs在420 nm 处的荧光发射，但560 nm 处的黄色荧光主要依赖于碳核发光，金属离子对其影响较弱，故PET对黄色荧光发射无明显影响［24］。随着Ag+浓度的增大，d-CDs 溶液在365 nm 紫外灯下显示出由蓝色至黄色的变化，并观察到溶液中产生絮凝物，推测是由于Ag+与d-CDs 表面的巯基结合导致碳点表面能量陷阱大量缺失，引起荧光猝灭；而Ag+对碳核560 nm 处的黄色荧光影响不明显，故随着蓝色荧光的减弱，体系发光由黄色荧光主导，荧光发射明显增强。由现有反应机理推测，该体系主要表现出420 nm 处的蓝色荧光和560 nm 处的黄色荧光竞争发射的情况，在碳点比率荧光检测金属离子的应用方面具有一定的实践意义。

2.7 实际样品检测

选择湖水、自来水和矿泉水作为实际样品，经离心过滤处理后，进行3 个不同浓度（0、5、10µmol/L）的加标回收实验，结果如表2 所示。实际样品的加标回收率为98.2%～105%，相对标准偏差（RSD）为0.49%～3.8%。结果表明该d-CDs比率荧光传感器能够可靠、有效地检测实际样品中的Ag+。

表2 实际样品的加标回收率Table 2 Spiked recoveries of real samples

3 结 论

本研究通过将B-CDs 与Y-CDs 杂化形成d-CDs，构建了一种特异性识别Ag+的可视化比率荧光传感器。通过对d-CDs 进行表征和光学特性分析，研究了其对Ag+的响应机制。结果表明，Ag+能与d-CDs 表面官能团发生配位形成d-CDs/Ag+复合物，推测可能是碳点表面官能团与金属离子络合产生的PET 猝灭了体系的蓝色荧光。另外Ag+能够与d-CDs 中的巯基结合产生絮凝物，随着蓝色荧光的减弱，体系呈现出黄色荧光增强的现象。将d-CDs 传感器应用于环境水样的检测，加标回收率为98.2%～105%，方法检出限为1.26 µmol/L。同时通过紫外灯照射可肉眼直观半定量检测Ag+。以上结果证实了所构建的可视化比率荧光传感器检测环境水样中Ag+的可靠性与实用性。本探针设计简便、灵敏度高、可靠性强，在现场快速检测和资源匮乏地区水质检测中具有较大的应用前景，并为未来纸基传感器的研究提供了一定的理论依据。