多波长自动融合指纹图谱策略及其在蜂胶质量评价中的应用

姜慧洁，章 越，慎凯峰，姜 艳，周丹英，赵洪静

（1. 浙江省中药研究所有限公司，浙江 杭州 310023；2. 国家市场监督管理总局食品审评中心，北京 100070）

蜂胶收载于2020 年版《中国药典》，为蜜蜂科昆虫意大利蜂（Apis melliferaL.）工蜂釆集的植物树脂与其上颚腺、蜡腺等分泌物混合而成的固体胶状物，蜂胶乙醇提取物是用乙醇浸提蜂胶得到的物质［1-2］。蜂胶中大量的黄酮和多酚类物质与其生理活性密切相关，建立蜂胶中黄酮和多酚类物质的指纹图谱方法是提高蜂胶质量评价的重要手段［3-4］。研究蜂胶指纹图谱的文献大多采用270、280、310 nm或者其他单一波长作为检测波长。由于黄酮、多酚等物质的紫外吸收不一致，导致单波长指纹图谱所包含的信息量不够全面，不同指纹图谱间的差异不明显，相似度评价或化学模式识别不显著［5-9］。

目前多波长融合技术是丰富指纹图谱信息的一种重要手段，只有合理整合各波长下各色谱峰的吸收信息，结合统计学辨识关键信息，才能准确表征待测样品的全组分质量［10-12］。有的多波长融合技术为切波长技术，即根据化学成分的不同保留时间选择不同的检测波长［13-15］。该方法增加了多组分下色谱峰的信息，但对方法保留时间的耐用性要求较高。有的多波长融合技术经过权重法、均值法和投影参数法等数学方法整合各波长的信息，然后进行综合的差异评价［16-17］。有的多波长融合技术通过多个波长的数据处理，融合成一个新的指纹图谱，再进行差异评价。如许平翠、于洋等［18-19］在不同波长色谱图上选择指纹峰信号最大且峰数最多的区段，采用Matlab软件进行等基线波长融合。Zhang等［20］介绍的多波长指纹图谱融合方案为设定主波长与次波长，若某个次波长的色谱峰峰面积大于主波长的，则次波长的色谱峰峰面积信息替换主波长的，形成新的峰面积棒状色谱图。该多波长融合的数据需人工处理，若指纹图谱的色谱峰、检测波长及样品批次多，则数据处理过程较费时。Yang、Yan、马迪迪等［21-23］提出的多波长指纹图谱融合方案需使用“中药指纹超级信息特征数字化评价系统”软件构建一个新的指纹图谱，该软件属于具有专利的收费软件，其他科研人员无法直接使用。上述文献中对于多波长数据的融合处理较为繁琐或需要特殊软件，不利于融合指纹图谱的推广应用。

本研究提出了一种可以简化数据处理过程的多波长自动融合指纹图谱策略，并以蜂胶乙醇提取物为研究对象进行质量评价。通过超高效液相色谱（UPLC）技术采集蜂胶多个波长下的指纹图谱信息，巧妙运用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”软件，简化了多波长数据融合的复杂处理过程，准确生成多波长融合指纹图谱，并进一步通过相似度评价、主成分分析和聚类分析比较了不同厂家蜂胶的质量差异。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

超高效液相色谱仪（1260 Infinity II Prime LC，安捷伦公司）；十万分之一电子天平（XS105DU，梅特勒公司）；万分之一电子天平（ME204，梅特勒公司）；数控超声波清洗器（KQ-500，昆山市超声仪器有限公司）。

15批中国蜂胶乙醇提取物分别来源于杭州天厨蜜源保健品有限公司、浙江福赐德天然蜂产品有限公司、浙江蜂之语蜂业集团有限公司、浙江金童生物科技有限公司、浙江知元堂生物药业有限公司，蜂胶原料均为杨树属，产地浙江（见表1）。芦丁（批号100080-202012，纯度92.2%，下同）、槲皮素（100081-201610，99.1%）、山奈素（110861-201611，95.5%）、芹菜素（111901-202004，99.4%）、异鼠李素（110860-201611，99.8%）、绿原酸（110753-202119，96.3%）、阿魏酸（110773-201915，99.4%）、异阿魏酸（111698-201904，99.3%），购于中国食品药品检定研究院；杨梅素（PS001011，98.0%）、咖啡酸（PU1191-0025，98.0%）、ρ-香豆酸（PS1415-0100，98.0%）、3，4-二甲氧基肉桂酸（PS2514-1000，98.0%）、肉桂酸（PU0942-0050，98.9%）、咖啡酸苯乙酯（PS1444-0050，98.0%），购于成都普思生物科技股份有限公司；乔松素（MUST-17022604，纯度99.52%）、白杨素（MUST-17040901，99.57%）、高良姜素（MUST-17020912，98.73%）、异绿原酸A（MUST-22110413，98.46%）、异绿原酸C（MUST-22081001，99.77%），购于成都曼思特生物有限公司。阿替匹林C（A26GB159041，97.0%），购于上海源叶生物科技有限公司；甲醇（色谱纯，美国TEDIA）；甲醇、磷酸（分析纯，上海凌峰化学试剂有限公司）；纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）。

表1 蜂胶样品信息Table 1 Sample information of propolis

1.2 多波长自动融合指纹图谱策略

多波长自动融合指纹图谱策略的步骤包含：①UPLC分析方法的开发；②多批次样品的多波长检测与数据收集；③多波长数据的自动融合；④融合对照指纹图谱的生成与相似度评价；⑤多波长融合数据的化学模式识别。其中步骤③基于均值法，即A=（a1+a2+……an）/n，式中A为融合指纹图谱中某个峰的峰面积，a为单波长指纹图谱中某个峰的峰面积，n为检测波长数量。仅通过运用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”软件即可完成多波长数据的融合处理，且处理过程基本不受指纹图谱复杂程度的影响。

1.3 蜂胶多波长自动融合指纹图谱的研究

1.3.1 蜂胶UPLC 指纹图谱方法色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（Agilent，Poroshell 120 EC-C18，3 mm×100 mm，2.7 µm）；以甲醇（A）-0.2%磷酸水溶液（B）为流动相，梯度洗脱：0～3 min，15%～25% A；3～13 min，25%～40% A；13～38 min，40%～48% A；38～45 min，48%～55% A；45～55 min，55%～75% A；55～60 min，75%～90% A；60～65 min，90%～15% A；流速为0.6 mL/min；柱温为35 °C；检测波长为220、245、270、320 nm。

供试品溶液的制备：取样品0.25 g，精密称定，置于25 mL容量瓶中，加入甲醇20 mL，超声处理30 min（功率250 W，频率40 kHz），放冷，用甲醇定容至刻度，摇匀，过滤，取续滤液，即得。

对照品溶液的制备：取芦丁、杨梅素、槲皮素、山奈素、芹菜素、异鼠李素、乔松素、白杨素、高良姜素、绿原酸、咖啡酸、ρ-香豆酸、阿魏酸、异阿魏酸、异绿原酸A、3，4-二甲氧基肉桂酸、异绿原酸C、肉桂酸、咖啡酸苯乙酯、阿替匹林C 对照品适量，精密称定，加甲醇制成质量浓度依次为21.74、25.82、15.75、22.87、54.68、12.22、9.43、47.17、14.44、13.85、17.89、19.50、9.50、17.92、17.45、20.85、16.57、19.43、19.50、22.55 µg/mL的混合对照品溶液。

测定法：分别精密吸取供试品溶液与对照品溶液3 µL，注入液相色谱仪，测定，对色谱图进行积分处理，导出各样品在220、245、270、320 nm波长处的AIA文件。

1.3.2 蜂胶多波长数据的自动融合方法依次将每个样品在4个波长处的AIA文件导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”（2012.130723 版本），参照图谱为S1，对照图谱生成方法为平均数，时间窗宽度为0.1，全峰匹配生成多波长融合指纹图谱，并单独导出XScp 文件。指纹图谱软件自动识别同一样品不同波长下相同保留时间的色谱峰，多波长融合指纹图谱中各色谱峰的保留时间即为原色谱峰的保留时间，各色谱峰的峰面积为多波长下峰面积加和的平均值，不同批次样品的指纹图谱在自动融合时均遵循相同的处理规则。

1.3.3 多批次蜂胶多波长融合指纹图谱的生成将收集的15 批蜂胶样品按照上述方法测定，依次生成多波长融合指纹图谱。将生成的15 批蜂胶多波长融合指纹图谱XScp 文件重新导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”，生成多波长融合对照指纹图谱。其中生成的融合对照指纹图谱的保留时间即为多个融合指纹图谱各色谱峰的保留时间加和平均值，峰面积即为多个融合指纹图谱各色谱峰的峰面积加和平均值。

1.4 单波长与多波长融合模式的对比

通过“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”、Excel软件、SIMCA 13.0统计分析软件，分别从共有色谱峰、相似度评价、主成分分析、聚类分析方面对蜂胶270 nm 波长指纹图谱和多波长融合指纹图谱进行对比。

2 结果与讨论

2.1 蜂胶多波长融合指纹图谱的研究

2.1.1 多波长的选择依据根据文献调研考察了20种黄酮与酚酸类对照品，根据色谱峰的定性研究，蜂胶指纹图谱中可定性14个共有峰，故测定了14个代表性黄酮、酚酸类成分的紫外吸收曲线，各成分的最大吸收值见表2。若选择的检测波长数量过多或存在不合适的波长，则经过各个波长下同一个物质色谱峰的加和平均后，色谱峰的峰面积偏小，差异性反而下降。蜂胶预实验的检测波长为220、245、270、320、360 nm，但在数据处理时发现360 nm 下的成分较少，且此时，这些成分在320 nm 波长下均有体现，综合考虑选择220、245、270、320 nm这4个波长全面表征蜂胶成分信息。波段分布均匀且基本涵盖了各成分的最大吸收值。

表2 各黄酮、酚酸类成分的最大紫外吸收情况Table 2 Maximum UV absorption of various flavonoids and phenolic acids

2.1.2 多波长融合指纹图谱的生成单个蜂胶样品的4个单波长指纹图谱经过软件自动融合形成1个多波长融合指纹图谱（见图1A）。相同方法处理后得到15批蜂胶样品的多波长融合指纹图谱（见图1B）。

图1 4个波长生成的融合指纹图谱（A）以及15批蜂胶的多波长融合指纹图谱（B）Fig. 1 Fusion fingerprint generated by wavelengths （A） and multi-wavelength fusion fingerprints of 15 batches of propolis （B）

2.1.3 多波长融合指纹图谱的方法学考察由多波长融合对照指纹图谱（图2B）可以看出，8号峰峰面积大小适宜，分离效果较好，通过对照品对比定性为槲皮素，故选其作为参照峰用于计算相对保留时间与相对峰面积。取同一份蜂胶供试品溶液连续进样5 次，进行精密度检测。结果显示融合共有色谱峰的相对保留时间的RSD 为0.02%～0.16%，相对峰面积的RSD 为0.56%～3.85%，表明液相检测方法与融合图谱生成方法的精密度较好。取同一份蜂胶供试品溶液，在0、4、8、12、24 h 进行稳定性检测。经计算融合共有色谱峰的相对保留时间的RSD 为0.04%～0.15%，相对峰面积的RSD 的为0.97%～4.67%，方法的稳定性较好。取同一份蜂胶样品，按照供试品溶液制备方法分别制备5份，依次进行检测，结果显示融合共有色谱峰的相对保留时间的RSD 为0.01%～0.13%，相对峰面积的RSD 为1.02%～4.39%，方法的重复性良好。

图2 单波长对照指纹图谱（A）、多波长融合对照指纹图谱（B）与对照品色谱图（C）Fig. 2 Single wavelength reference fingerprint（A），multi-wavelength fusion reference fingerprint（B），and reference chromatogram（C）

2.2 单波长指纹图谱与多波长融合指纹图谱的对比

2.2.1 对比波长的选择以蜂胶270 nm 单波长指纹图谱与多波长融合指纹图谱进行对比，主要原因如下：2005 版《中国药典》中蜂胶的含量测定为白杨素（268 nm）、高良姜素（268 nm）［24］，2020版《中国药典》为白杨素（270 nm）、高良姜素（270 nm），增加了乔松素（289 nm）、咖啡酸苯乙酯（329 nm）含量的测定［1］。行业标准中蜂胶多种成分含量测定或指纹图谱的波长为280、360 nm［25-27］。知网文献中蜂胶多种成分含量测定或指纹图谱的波长为270、280、290、310 nm［5-9］。即黄酮成分的检测波长倾向270、280 nm，酚酸成分的检测波长倾向310、360 nm。表明前期蜂胶成分研究更侧重于黄酮成分，且270 nm 检测波长下蜂胶指纹图谱的色谱峰信息较为全面，可作为与多波长融合指纹图谱分析的对比图谱。

2.2.2 共有色谱峰的对比蜂胶270 nm 单波长指纹图谱研究中，15批样品有33个共有色谱峰，其中峰面积大于500 的色谱峰19 个，大于400 的25 个，大于300 的29 个，大于200 的32个，选择峰面积大于200 的32 个色谱峰为特征峰。蜂胶270 nm 单波长对照指纹图谱含有32 个特征峰（表3），其中12 个特征峰可定性（见图2A），特征峰的信息见表3。由表3 可知，特征峰保留时间的RSD 均小于1.00%，峰面积的RSD 为14.33%～113.62%，平均值为35.24%。

表3 蜂胶单波长对照指纹图谱（270 nm）的特征峰信息Table 3 Characteristic peak information of propolis single wavelength reference fingerprint （270 nm）

蜂胶多波长融合指纹图谱研究中，15批样品共有的色谱峰有44个，其中峰面积大于500的色谱峰22个，大于400的26个，大于300的27个，大于200的33个，选择峰面积大于200的33个色谱峰为特征峰。这些特征峰中有14 个可定性（见图2B、2C）。相比于270 nm 单波长，可定性的特征峰中增加了咖啡酸和阿魏酸特征峰。蜂胶多波长融合对照指纹图谱的特征峰信息见表4，特征峰保留时间的RSD均小于1.00%，保留时间的差异较小，即建立的蜂胶融合指纹图谱作为质量控制方法具有科学性。特征峰峰面积的RSD 为14.39%～112.02%，平均值为37.94%，峰面积之间差异较大，说明不同厂家蜂胶之间的黄酮、酚酸等成分种类较相似，但含量存在差异。

表4 蜂胶多波长融合对照指纹图谱的特征峰信息Table 4 Characteristic peak information of propolis multi-wavelength fusion reference fingerprint

2.2.3 相似度评价的对比对15批蜂胶的270 nm 单波长指纹图谱和多波长融合指纹图谱分别进行相似度分析，结果见表5。15 批样品单波长指纹图谱的相似度较高，为0.928～0.997，其中S14、S15 的相似度相对较低。各融合指纹图谱与对照指纹图谱的相似度为0.902～0.994，与单波长相比，多个样品的相似度均明显下降，说明多波长融合指纹图谱更能全面分析各批次之间的差异性。但各批次的相似度仍然较高，表明不同批次的蜂胶乙醇提取物表现出了良好的相似度，即浙江不同厂家产品的整体质量较为稳定，所含成分种类较为一致。

表5 蜂胶指纹图谱的相似度评价结果Table 5 Similarity evaluation results of propolis fingerprint

2.2.4 主成分分析的对比以15批蜂胶270 nm单波长指纹图谱中32个特征峰的峰面积为变量，输入SIMCA 13.0 统计分析软件进行模型分析，将主成分数量设置为3 时，模型的R2X=0.901，Q2=0.757，即前3个成分的累积贡献率达90.1%，模型拟合良好。进一步进行主成分分析（PCA），可将所峰胶样品分为3 类（图3A），一类是S4～S10，即厂家2 和厂家3；一类是S11～S13，即厂家4；一类是S1～S3 和S14～S15，即厂家1 和厂家5。同一类样品的特征峰峰面积大小较接近。同一厂家不同批次的样品基本稳定，聚为一类；厂家2和厂家3的样品较一致，无法区分。

图3 单波长（A）与多波长（B）蜂胶指纹图谱的主成分分析Fig.3 Principal component analysis of single wavelength（A） and multi-wavelength（B） propolis fingerprint

（续表3）

以15批蜂胶融合指纹图谱中33个特征峰的峰面积为变量进行模型分析，主成分数量设置为3，模型的R2X=0.923，Q2=0.790，前3 个成分的累积贡献率达92.3%，模型拟合良好。主成分分析结果见图3B，样品可被分为4 类，一类是S4～S10，即厂家2 和厂家3；一类是S11～S13，即厂家4；一类是S1～S3，即厂家1；一类是S14～S15，即厂家5。相比单波长的主成分分析更有区别性，能将厂家1和厂家5的样品进行区分。

其中270 nm 单波长主成分1 中各色谱峰的载荷情况见图4A。峰5、7、9、10、11、12、17、18、21、23、24、25 的值大于0.2，对主成分1的贡献较大。多波长融合主成分1中各色谱峰的载荷情况见图4B。峰1、7、10、11、13、19、21、24、28 的值大于0.2，对主成分1 的贡献较大。同蜂胶270 nm单波长图谱的分析结果相比，蜂胶融合指纹图谱中0～20 min 保留时间的色谱峰加强，增加了酚酸类成分的特征峰，如咖啡酸、阿魏酸，并且平衡了某些峰面积较大成分对差异性评价的影响（如白杨素）。

图4 单波长（A）与多波长（B）主成分1中各色谱峰的载荷图Fig.4 Load graph of each chromatographic peak in single wavelength（A） and multi-wavelength（B） principal component 1

2.2.5 聚类分析的对比在3 个主成分的基础上，采用Ward 法计算距离，以平方欧氏距离为分类依据，进行聚类分析（HCA），绘制15 批蜂胶270 nm 单波长指纹图谱的聚类分析图，见图5A。当距离为50时，可将样品分为3类，一类是S4～S10、一类是S11～S13、一类是S1～S3和S14～S15，同主成分分析的结果吻合。

图5 单波长（A）与多波长（B）蜂胶指纹图谱的聚类分析Fig.5 Cluster analysis of single wavelength（A） and multi-wavelength（B） propolis fingerprint

采用同样方法与参数绘制15批蜂胶融合指纹图谱的聚类分析图，见图5B。当距离为100时，可将样品分为3 类，分类结果与单波长指纹图谱分类结果一致。当距离为50 时，可将样品分为4 类。一类是S4～S10，即厂家2、厂家3；一类是S11～S13，即厂家4；一类是S1～S3，即厂家1；一类是S14～S15，即厂家5，同主成分分析的结果基本吻合。当距离继续减小时，S4～S10 也能进行划分，除批次S6，其他均能正确分类。表明在主成分分析、聚类分析处理上，多波长融合指纹图谱的分类更加准确，提高了对色谱指纹图谱差异性的评价能力。

3 结 论

本研究简化了多波长融合指纹图谱数据的自动融合处理过程，拓展了开源软件“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”的功能，可对多波长数据进行快速、自动融合处理，减少了人工对繁琐数据的汇总、筛选、对应、加和与图像生成等处理。多个单波长的指纹图谱在遵循同一处理规则下自动融合生成一个新的多波长融合指纹图谱，每个色谱峰即为不同波长下同一保留时间色谱峰的加和平均值。该数据融合处理策略虽属于低级数据融合技术，但简单快速，最大化地准确保留了各色谱峰的信息，利于融合指纹图谱的应用与普及。建立的蜂胶多波长融合对照指纹图谱含有33个特征峰，其中14个特征峰可定性，7 个为黄酮成分，7 个为酚酸成分，15 批蜂胶融合指纹图谱的相似度为0.902～0.994，主成分分析、聚类分析可将样品分为4 类。将多波长自动融合指纹图谱策略应用于蜂胶质量评价中，可丰富黄酮、酚酸类物质在不同波长下的色谱信息，降低高峰面积成分对整体评价的影响，提高指纹图谱差异评价的准确性，为蜂胶质量控制提供参考与借鉴。但本研究中，蜂胶乙醇提取物样品的收集范围较小，样品均来源于浙江厂家，所建立的多波长融合指纹图谱仅适用于不同厂家蜂胶提取物的区分。后续将进一步对不同省份、不同季节、不同提取工艺、不同种属的蜂胶进行深入分析，提高多波长融合指纹图谱在蜂胶质量评价中的应用范围。