猫血浆对称性二甲基精氨酸参考范围的建立及其影响因素

林璐琪,陈丝雨,林嘉宝,夏兆飞

(1.中国农业大学动物医学院,北京 海淀 100193 ; 2.中国农业大学教学动物医院,北京 海淀 100193)

慢性肾病(Chronic kidney disease,CKD)是猫最常见的疾病之一,在10岁及以上的老年猫中CKD发病率为30%～60%[1,2]。血清肌酐(Creatine,CREA)常用于CKD的诊断,但其水平受肌肉量显著影响且不能有效诊断早期CKD,因此,寻找可靠的生物标记物对CKD早期诊断尤为重要。对称性二甲基精氨酸(Symmetric dimethylarginine,SDMA)是在蛋白质降解过程中,由精氨酸甲基化形成的分子[3]。研究表明,血清SDMA水平与动物的肾小球滤过率(Glomerular filtration rate,GFR)相关性良好[4],且不易受到动物体况和营养状况的干扰[5,6]。

近年来,国外对猫SDMA的研究逐渐增多,而国内少见健康猫和CKD 患猫体内 SDMA水平变化的相关报道。本试验旨在分析:(1)建立国内健康猫血浆SDMA的参考范围,探究不同品种、性别、年龄和绝育状态对SDMA水平的影响;(2)分析不同疾病[CKD、心脏病(Heart disease,HD)、糖尿病(Diabetes mellitus,DM)、肿瘤、猫脂肪肝(Feline hepatic lipidosis,FHL)和猫传染性腹膜炎(Feline infectious peritonitis,FIP)]对猫 SDMA水平的影响。

1 材料与方法

1.1 试验动物和分组 于2018年6月—2019年1月收集中国农业大学教学动物医院收诊的287例猫病例,分为健康成年对照组(n=100)、慢性肾病组(n=140)、非慢性肾病组(n=47)(无氮质血症),其中非慢性肾病组分为HD组(n=8)、肿瘤组(n=15)、DM组(n=4)、FHL组(n=10)和FIP组(n=10)。健康成年对照组猫的纳入标准:(1)大于1岁;(2)无既往病史,体格检查正常;(3)血常规、生化、尿液和超声检查结果均正常。慢性肾病组患猫纳入标准:(1)存在氮质血症;(2)超声检查发现肾脏存在慢性损伤征象;(3)无其他并存疾病。非慢性肾病组患猫纳入标准:(1)无氮质血症;(2)临床检查、实验室检查和影像学检查等结果符合HD、肿瘤、DM、FHL和FIP的诊断标准[2]。

1.2 主要试剂 猫对称性二甲基精氨酸ELISA试剂盒,购自上海酶联生物科技有限公司。

1.3 主要仪器 西门子冰箱,博西华家用电器有限公司产品;全自动生化分析仪,东芝医疗系统(中国)有限公司产品;干燥培养恒温箱,天津市泰斯特仪器有限公司产品;微型离心机,杭州米欧仪器有限公司产品;多功能酶标仪,赛默飞世尔(上海)仪器有限公司产品。

1.4 猫SDMA参考范围的建立 取健康成年对照组猫血浆样本100份,应用猫对称性二甲基精氨酸ELISA试剂盒检测SDMA水平,建立 SDMA的参考范围,范围以平均数加 1.96 倍标准差表示[95%置信区间(Confidence interval,CI)]。

1.5 年龄、性别、品种对猫血浆SDMA水平的影响 根据收集到的健康成年对照组的病例信息,按照年龄将健康成年对照组猫分为青年组(1～3岁)、中年组(4～10岁)和老年组(≥11岁)3个年龄组;按绝育情况分为雄性组(n=30)、雌性组(n=30)、雄性去势组(n=26)和雌性绝育组(n=14);按照品种分成家养短毛猫组(Domestic short hair,DSH,n=30)、家养长毛猫组(Domestic long hair,DLH,n=20)、英国短毛猫组(British short hair,BSH,n=15)、美国短毛猫组(American short hair,ASH,n=15)、异国短毛猫组(Exotic short hair,ESH,n=8)、折耳猫组(Scottish Fold,n=4)、暹罗猫组(Siamese,n=3)和其他品种组(Others,n=5)8个品种组;评价不同年龄、性别、品种、绝育/去势状态对健康猫血浆SDMA水平的影响。

1.6 疾病因素对猫血浆SDMA水平的影响 根据国际肾病研究学会(International Renal Interest Society,IRIS)的分期指南[7],将CKD组患猫分成CKD-1期组(CREA<140 μmol/L,n=30)、CKD-2期组(CREA介于140～250 μmol/L,n=48)、CKD-3期组(CREA介于251～440 μmol/L,n=31)、CKD-4期组(CREA>440 μmol/L,n=31),检测以上4个组的血浆 SDMA水平。此外,检测临床非氮质血症的HD组(n=8)、肿瘤组(n=15)、DM组(n=4)、FHL组(n=10)和FIP组(n=10)的血浆 SDMA水平;分析不同疾病对该指标的影响和意义。

1.7 数据处理 使用SPSS 25.0(SPSS Inc.,Chicago,IL,U.S.A.)和GraphPad Prism 8.0(GraphPad Software Inc.,San Diego,U.S.A.)进行数据分析和图表制作。对于连续型数据,采用“平均数±标准差”来表示呈正态分布的数据,并采用单因素方差分析(One-way ANOVA)和 Turkey 事后检验来分析不同组之间的差异。而对于不呈正态分布的数据,以“中位数和上下四分位数”表示,并采用非参数检验Kruskal-Wallis来比较组间的差异。P>0.05表示差异不显著,P<0.05表示差异显著,P<0.01 表示差异极显著。

2 结果

2.1 健康成年猫SDMA参考范围 100 份健康成年对照组猫血浆样本的 SDMA水平呈正态分布(K-S 检验,P>0.05,图1)。经计算,健康成年猫的SDMA参考范围为0～13.09 μg/dL(CI:95%)。

图1 健康成年猫SDMA频数分布Fig.1 Frequency distribution of SDMA in healthy adult cats

2.2 年龄、性别、品种对猫血浆SDMA水平的影响 青年组、中年组和老年组的SDMA水平分别为(6.71±3.42)、(7.53±2.82)和(6.97±2.82) μg/dL,组间无显著差异(P>0.05)。雄性组、雌性组、雄性去势组和雌性绝育组的SDMA水平分别为(6.98±3.37)、(7.93±3.15)、(6.38±2.46)和(6.56±3.17) μg/dL,组间无显著差异(P>0.05)。不同品种分组的SDMA水平无显著差异(P>0.05,图2)。

图2 不同品种健康成年猫SDMA水平Fig.2 SDMA levels in healthy adult cats of different breeds

2.3 疾病因素对猫血浆SDMA水平的影响 对4个分期组CKD患猫进行血浆SDMA水平和CREA水平检测,结果显示,与健康成年对照组相比,CKD各分期组SDMA水平均出现极显著升高(P<0.01)(图3A),且SDMA水平与CREA水平呈强相关性(r=0.890;P<0.001)(图3B);血浆CREA水平在4个分期组间差异显著(P<0.05或P<0.01),但健康成年对照组的血浆CREA水平与CKD-1期组差异不显著(P>0.05)。

图3 不同CKD分期患猫SDMA水平(A)以及SDMA水平与CREA水平的相关性(B)Fig.3 SDMA levels in cats with different stages of CKD (A) and the correlation between SDMA levels and CREA levels (B)与前一组对比,*:差异显著,P<0.05; **:差异极显著,P<0.01。与健康成年对照组相比,#:差异显著,P<0.05; ##:差异极显著,P<0.01Compared with the previous group,*:significant differences,P<0.05; **:extremely significant differences,P<0.01.Compared with the healthy adult control group,#:significant differences,P<0.05; ##:extremely significant differences,P<0.01

对非氮质血症的HD组、肿瘤组、DM组、FHL组和FIP组病例进行 SDMA检测,结果显示,与健康成年对照组相比,FHL组和FIP组血浆SDMA水平均存在极显著差异(P<0.01),HD组血浆SDMA水平存在显著差异(P<0.05),肿瘤组和DM组血浆SDMA水平均不存在显著差异(P>0.05)(图4)。

图4 疾病因素对SDMA水平的影响Fig.4 Influence of disease factors on SDMA levels*:组间差异显著,P<0.05; **:组间差异极显著,P<0.01*:Significant differences between groups,P<0.05;**:Extremely significant differences between groups,P<0.01

3 讨论

本试验建立了猫血浆SDMA的参考范围,结果显示,健康成年猫血浆 SDMA水平不受品种、年龄、性别和绝育/去势状态的影响。根据相关指南[8,9]要求,正常参考范围的建立至少需要120个样本,但由于试验周期的局限性,本试验经过筛选获得了健康动物样本100份,结果可能会存在一定的误差,但整体数据符合正态分布,具有一定的参考意义。本试验猫血浆SDMA水平所建立的参考范围(0～13.09 μg/dL)与爱德士参考实验室(IDEXX Reference Laboratories)的参考范围(0～14 μg/dL)相似,但参考范围上限比IDEXX低一些,可能与样本来源地区、样本数量和检测方法差异相关,IDEXX的样本源于北美洲健康猫,而本试验的样本来自中国北京地区,本试验所用的ELISA试剂盒与IDEXX的高通量免疫测定法存在专利技术的差异,以及潜在的人为操作误差,均可导致参考范围的建立出现差别。

本试验的SDMA水平与CREA水平呈显著相关性,SDMA的r值(r=0.890;P<0.001)与Jepson等[10]试验报道的相近(r=0.741;P<0.001),表明SDMA和CREA类似,在指导分期和判断病情严重程度上具备相似的作用。但从文献中可知,CREA在肾功能平均下降75%时才表现出数值的异常,其敏感性较高而特异性较低;而SDMA在肾功能平均下降40%时就能表现出数值的异常,且比CREA早17个月(时间范围为1.5～48个月)检测出CKD[11],因此SDMA在诊断早期CKD上更具有优势。根据本试验的结果,SDMA应用于肾病早期诊断的建议是:当血浆SDMA水平大于13.09 μg/dL时,应筛查动物是否存在早期肾病,以提早发现潜在病因。由于国内宠物临床较难开展GFR检测,本试验未对血浆SDMA与GFR相关性展开研究,因此无法计算SDMA的敏感性和特异性。未来的课题需要针对患猫的GFR、尿检和血压做进一步关于慢性肾病SDMA水平的研究。此外,若饲主能够严格遵守医嘱,定期带动物复查,将有助于后期深入研究。

在老年猫中,心脏病和糖尿病是CKD常见的共存病,因此探究这2种疾病是否会影响SDMA水平尤为重要。Langhorn等[12]研究发现,血清SDMA水平在肥厚性心肌病组与健康成年组中无显著差异,但DM组整体水平低于健康成年组。人医现已发现,蛋白质精氨酸甲基转移酶(Protein arginine methyltransferase enzyme,PRMT)Ⅱ型(即PRMT5)与肿瘤有一定的关系,其活性增加会促进SDMA的生成[13],但相关研究还处于探索阶段。最近有关于犬猫SDMA水平与各类型肿瘤之间关系的研究结果表明,患有淋巴瘤动物的SDMA水平显著升高[14]。本试验结果显示,健康成年对照组血浆SDMA水平与肿瘤组和DM组差异不显著,与HD组差异显著。尽管健康成年对照组的SDMA水平均值与HD组差异显著,但HD组所有检测结果均在本试验所设立的参考范围内,所以本试验的结论是心脏病、糖尿病和肿瘤均不会显著影响血浆SDMA水平。鉴于上述疾病的样本量较少,若要探究其对SDMA的影响程度,仍需要更深入的研究。

人类医学研究显示,体内超过90%的SDMA通过肾脏清除[15],还有一部分通过肝脏清除[16],当肝脏出现功能异常时,可能会引起SDMA水平的升高,脂肪肝、胆管炎、中毒和病毒病都可能会影响肝脏的功能。但也有2篇人医的报道表明,SDMA水平完全不受肝脏的影响[17,18]。本试验结果显示,健康成年对照组血浆SDMA水平与FHL组和FIP组均存在极显著差异,表明FHL和FIP可能会显著影响SDMA水平。FIP多发于幼猫,这种疾病的影响是全身性的,所以当SDMA水平在幼年动物体内显著升高时,除了考虑肾脏的问题,可能还需要注意是否存在代谢性或全身性疾病。但目前兽医缺乏此类报道,因此需要进一步研究验证。

综上所述,血浆SDMA具有诊断猫早期慢性肾病的价值,但不能单独作为慢性肾病的生物标记物使用,仍需要结合临床症状、临床病理学检查和影像学检查共同评估。