猪轮状病毒抗原蛋白相关特性的研究进展

于洪敏,单春乔,梁方印,李 娟,王 岩,刘 艳

(1. 大连三仪动物药品有限公司,辽宁 大连 116000 ; 2. 濮阳县农业农村局,河南 濮阳 457000)

急性腹泻引起的猪群胃肠道感染是十分棘手的问题,也是导致仔猪死亡的重要原因之一,该病的传播严重阻碍了养猪业的健康发展。该病可由病毒、细菌和寄生虫引起,而在这几种病原体中,猪轮状病毒(Rotavirus,RV)被认为最重要且最常见[1]。猪轮状病毒属于呼肠孤病毒科、轮状病毒属,在我国生猪养殖业中广泛存在,特别是密集型商业养猪场尤为易感,且该病毒引起的猪场大规模感染和腹泻不分年龄阶段[2],因此研发有效防治该病毒的药物或疫苗至关重要。本文简述了猪轮状病毒的特点及其抗原蛋白的特性,以期获得一些基线信息,制定未来的防疫策略,保护养猪业免受这一重要病原体的影响。

1 猪轮状病毒感染的临床症状

猪轮状病毒感染发生于10～60日龄仔猪,发病率高达80%,新生仔猪感染该病毒后的死亡率可达100%。该病毒感染引起的主要症状是精神萎靡、厌食、不愿走动,仔猪患严重的胃肠炎和小肠病变,出现脱水性腹泻,同时该病毒还可破坏机体的酸碱平衡,致使仔猪生长缓慢,严重制约了我国养猪业的健康发展,给我国养猪业造成了巨大的经济损失[3-5]。近年来,不仅越来越多的仔猪由于感染猪轮状病毒而发生死亡,大猪和种猪往往也呈隐性感染,而且一旦感染猪轮状病毒,会严重影响机体的生长发育,即使恢复健康的成年猪也会停止生长,猪场淘汰率明显升高。

2 猪轮状病毒的病原学特征

猪轮状病毒的外形似车轮,无囊膜,呈二十面体对称,中央为核酸构成的芯髓,呈致密的六角形(图1)[6],该病毒核酸中富含大量的A/T碱基对,含量大约在65%,这也是其与大多数病毒的不同之处。猪轮状病毒是分节的双链RNA(Double-stranded RNA,dsRNA)病毒,由11个片段编码6个结构蛋白和6个非结构蛋白,结构蛋白包括VP1、VP2、VP3、VP4、VP6和VP7,非结构蛋白包括NSP1、NSP2、NSP3、NSP4、NSP5和NSP6[7],各种蛋白的电泳迁移情况如图2所示[8]。病毒粒子由3层衣壳蛋白构成,最内层由VP2及少量VP1和VP3蛋白组成,三者共同包裹病毒基因组RNA,形成病毒基因组的核心封装和复制复合体,是病毒基因转录和复制过程中不可缺少的蛋白;中间层由VP6 蛋白组成,呈辐条状;最外一层由VP7和VP4两种蛋白质组成,其中VP7蛋白形成病毒的光滑表面,VP4蛋白形成病毒颗粒的尖峰,二者是病毒血清型的主要决定因素[9,10]。

图1 猪轮状病毒的病毒粒子结构示意图[6]Fig.1 Schematic diagram of the viral particlestructure of porcine rotavirus[6]

图2 猪轮状病毒双链RNA及其编码蛋白的电泳迁移谱[8]Fig.2 Electrophoretic migration profiles of viral dsRNA and encoded proteins[8]

3 猪轮状病毒的分群依据和各群差异

猪轮状病毒VP6蛋白既是核衣壳蛋白也是该病毒的群抗原,根据VP6的抗原特性,将该病毒分为A～J共10个基因群,其中与猪的临床和经济密切相关的常见群体是A、B和C基因群,而家畜育种中常诊断出A群轮状病毒感染,因此,A群轮状病毒被认为是引起猪腹泻的主要基因群[11]。根据糖蛋白VP7(G型)和外衣壳蛋白VP4(P型)的抗原特性,可将轮状病毒分为G型和P型,A群猪轮状病毒的12个G基因型和16个P基因型都与猪相关,G3、G4、G5、G9和G11是猪最常见的G基因型,最常见的基因型组合为G9P[23]、G4P[6]和G9P[32];C群猪轮状病毒有G1、G3、G5～G10基因型,而与之相组合的P基因型是由不同毒株间基因的亲缘关系决定的[12,13]。为了评估猪轮状病毒之间的遗传差异,不少学者使用这种双重遗传分类方法,目前该方法已被广泛接受并应用于基因型的鉴定,基于双重分型系统,国内外已经发表了多篇基于双重分型系统的猪基因型研究相关文献。

4 猪轮状病毒抗原蛋白的致病机理

猪轮状病毒的病毒粒子表面有3种抗原蛋白:中和抗原、群抗原和血凝素抗原。中和抗原主要由第9节段编码的外壳糖蛋白VP7所决定;群抗原与多种结构蛋白相关,主要是由第6节段编码的内衣壳蛋白VP6所决定;血凝素抗原由第4节段编码的外衣壳蛋白VP4所决定。感染早期,猪轮状病毒经黏膜感染引起消化道病变,最严重的部位是小肠,病毒粒子主要集中在小肠绒毛顶部表面的成熟吸收上皮细胞中,导致小肠从上部到下部均发生病变。感染后期,该病毒破坏成熟的肠细胞,导致肠道吸收不良或发生渗透性腹泻,在感染动物的血液和全身器官中可以检测到病毒抗原、基因组RNA和感染性颗粒[14,15]。

4.1 抗原蛋白VP4致病机理 VP4蛋白具有血凝作用,能够促进病毒入侵、融合细胞膜,与病毒粘附、侵入和血凝性相关,此外,VP4蛋白还决定病毒毒力,是病毒的主要识别因子之一,其可介导血清型特异性,在病原检测和中和抗体产生以及免疫性保护过程中都具有重要意义[16,17]。病毒感染后,VP4蛋白与宿主细胞相互作用,参与受体结合和细胞渗透,VP4蛋白可被蛋白酶水解,被切割成C端VP5和N端VP8两条长度不等的片段,裂解后增强了病毒的感染能力。酶解后的VP5在最初被靶细胞摄取后穿过包围它的囊泡膜的脂质双分子层,使细胞膜的渗透性增加,从而促进病毒进入细胞内;VP8含有能粘附唾液酸的部位,可将病毒附着在其细胞受体上,改变上皮细胞的分子结构和功能,对上皮细胞造成破坏,导致小肠绒毛长度变短、密度降低,来自肠隐窝的未成熟细胞代替成熟细胞,从而引起吸收障碍、消化不良和渗透性腹泻[18,19]。

4.2 抗原蛋白VP6致病机理 结构蛋白VP6具有抗原特异性、免疫原性和转录活性,能够参与病毒转录,并与其他蛋白发生相互作用,指导结构蛋白和非结构蛋白的合成,对于病毒感染细胞、病毒复制和发挥致病功能都十分重要。在病毒感染早期,VP6蛋白主动诱导黏膜免疫反应并产生免疫球蛋白A(Immunoglobulin A,IgA),聚合型IgA能够使轮状病毒从肠上皮细胞的基底外侧膜经胞浆作用进入肠腔,并使产生IFN-γ的T细胞显著增多,诱导多种促炎细胞因子和趋化因子的分泌[20]。

4.3 抗原蛋白VP7致病机理 糖蛋白VP7是病毒外衣壳中含量最高的蛋白,其高度保守,是病毒的主要识别因子,能够诱导机体产生细胞免疫和体液免疫,并产生特异性抗体IgA和IgG[21,22]。VP7蛋白作为最外层的衣壳蛋白,可介导病毒粒子的吸附,并通过与细胞表面的整合素受体α2β1和α4β1结合,使猪轮状病毒粘附并进入细胞[22]。VP7蛋白的结构是可维持钙离子稳定的三聚体,因此能帮助VP4蛋白锚定在病毒粒子感染的细胞表面,通过钙离子依赖性结合钙离子,从而应对感染早期钙离子的损失,具有稳定VP4蛋白结构和保障VP4蛋白发挥功能的作用[23,24]。

5 猪轮状病毒抗原蛋白的免疫学特性

目前,临床中尚无针对猪轮状病毒的特效药物,尽管接种疫苗是防控该病毒感染的主要方法,但仔猪因感染该病毒而引起的严重腹泻仍未完全解决。猪轮状病毒多经黏膜感染机体,所以口服免疫可能是较为理想的预防途径。口服免疫可有效刺激黏膜免疫细胞产生分泌型免疫球蛋白A(Secretory immunoglobulin A,sIgA),并进一步引起全身免疫反应,由此一些学者便试图从猪轮状病毒抗原蛋白免疫学特性的相关研究中找到能有效控制该病的方法,研究内容见表1。

表1 猪轮状病毒抗原蛋白的免疫学特性相关研究Table 1 Study on immunogenic characteristics of porcine rotavirus antigenic protein

6 小结

猪轮状病毒病是生猪养殖过程中的一种常见疾病,尤其是由其导致的仔猪腹泻频繁暴发,给养猪场带来巨大的经济损失。VP4、VP6和VP7蛋白是猪轮状病毒主要的抗原蛋白,也是导致腹泻的重要毒力因子,最近有文献报道除上述3种蛋白外,肠毒素NSP4蛋白也是该病毒的主要毒力因子之一,与该病毒引起的腹泻密切相关[34],虽然尚没有研究显示NSP4属于猪轮状病毒的抗原蛋白,但该蛋白在病毒粒子的装配和感染过程中也起到了重要作用,且对与其共免疫的抗原具有增强免疫原性的佐剂作用,可作为重要的抗原免疫刺激剂[35,36]。猪轮状病毒抗原蛋白相关特性的深入研究对亚单位疫苗的研制至关重要,其应用前景十分广阔,尤其在无特效治疗药物和理想疫苗的情况下,对猪群腹泻的防治和人类公共卫生的提升均具有重要意义,有望使猪轮状病毒病得到有效的防控。