空间转录组技术在消化系统肿瘤研究中的应用进展

轩晨礒 牛旭东 淳雨婕 王绍清 王显艳

作者单位：161006 齐齐哈尔 齐齐哈尔医学院1基础医学院，2病理学院

近年来，单细胞测序技术，尤其是单细胞RNA 测序（single-cell RNA sequencing，scRNA-seq）成为揭示肿瘤细胞异质性的有效手段。然而，scRNA-seq 在单细胞水平上分析细胞RNA 表达的前提是需要把组织解离成单个细胞状态，在这一过程中可能会丢失其原始的空间信息［1］。空间转录组技术结合组织学成像和RNA 测序，定量检测基因表达水平的同时提供相应的空间位置信息，这有助于更好地确定肿瘤异质性的来源，揭示其致病机制、潜在的药物靶点和新的生物标志物［2］。在消化系统肿瘤研究中，空间转录组技术显示了一定的应用前景。本文就空间转录组技术及其在消化系统肿瘤研究中的应用进展作一综述。

1 常见的空间转录组技术

空间转录组技术根据检测原理可分为四大类，包括基于原位杂交（in situ hybridization，ISH）、原位测序（in situ sequencing，ISS）、激光捕获显微切割（laser capture microdissection，LCM）和基于原位捕获的空间转录组技术。在ISH 中，来自组织内各个部分（或细胞）的RNA分子通过与特定标记的已知序列的探针杂交，从而获取靶基因的表达情况。与初始ISH相比，单分子RNA 荧光原位杂交（single-molecule fluorescence in situ hybridization，smFISH）具有更强、更稳健的信号。顺序荧光原位杂交技术（sequential fluorescence in situ hybridization，seqFISH）、多重抗误差矫正荧光原位杂交技术（multiplexed erorr-robust fluorescence in situ hybridization，MERFISH）等提高了检测的靶通量。在ISS 中，来自细胞的RNA 分子直接在其组织环境中进行测序，虽然大多数基于ISS 的空间转录组技术都具有亚细胞分辨率，但是其发展仍受靶基因数量与效率限制；基于LCM 技术是在显微镜下利用激光束切割出识别的特定组织区域，但并不适用于批量处理样品。基于原位捕获技术是通过捕获RNA 分子进行非原位cDNA 测序，在保留较高通量的同时还具有亚微米分辨率等优势。在消化系统肿瘤中，空间转录组技术可用于识别其空间异质性和基因表达谱，以揭示肿瘤的发生、发展和转移机制。空间转录组技术的原理见图1［3］。

图1 常见的空间转录组技术[3]Fig.1 Common spatial transcriptome techniques[3]

1.1 基于原位杂交的空间转录组技术

ISH 技术主要用于定量检测组织切片中的核苷酸序列，而在该技术的基础上发展而来的荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）技术具有更高的安全性、稳定性和定位准确性，而且可获得基因的表达信息，目前被广泛应用于细胞生物学和基因组学的研究以及肿瘤学的临床诊断［4-6］。其中，smFISH 是最早崭露头角的FISH，它采用多个单链荧光标记的短DNA 探针与该探针互补的靶RNA 进行杂交，通过数字显微镜成像将细胞中的单个基因表达水平可视化［7］。该技术虽然具有高灵敏度和高分辨率的优势，但受荧光团种类限制，检测通量和效率较低［8］。为提高smFISH 的检测通量，LUBECK 等［9］开发了顺序荧光原位杂交技术，通过将一系列探针与每个转录本进行多轮杂交来实现大通量分析，增加了FISH 信号强度。然而，随着杂交次数的增加，检测转录本数量增长，耗时增加，误差也逐渐增大。由ENG等［10］开发的seqFISH 技术利用顺序杂交和标准共聚焦显微镜成像，缩短了成像时间并进行多重分析纠错，提高了检测效率和准确性。考虑到seqFISH 耗时过长和误差较大，CHEN 等［11］提出了一种高度多路复用的smFISH 成像方法--MERFISH，该技术通过使用组合标记、顺序杂交和成像以及两种不同的错误鲁棒编码方案，可以在单个细胞中鉴定数千种RNA 的拷贝数及进行空间定位。MERFISH 不仅可通过错误鲁棒编码方案降低检测误差，控制检测成本，而且还可以使用组合标记方法缩短多轮杂交的总时间。总之，基于ISH 的空间转录组技术具备高分辨率、大通量检测等优势，但仍存在耗时长、误差大、成本昂贵等局限性。

1.2 基于显微切割的空间转录组技术

LCM 是一种在显微镜下通过显微操作系统对所选取的样本进行切割分离并收集应用的技术，其工作原理是将激光与倒置的显微镜结合，并通过计算机连接，实现直接可视化分析［12-13］。LCM最重要的优点在于高速、高精度及多功能性。然而，由于LCM 存在分析通量较低等局限性，其应用范围受到一定限制［14］。WU 等［15］提出了一种将LCM 与scRNA-seq 相结合并使用地理位置测序（Geo-seq）方法来高通量基因表达以分析精子发生过程中的特定生殖细胞。MOOR等［16］通过优化LCM-RNA-seq方法提取小肠绒毛上皮特异性标志基因，并利用其进行单细胞空间重建以获取肠细胞空间位置信息。此外，EZZOUKHRY等［17］将LCM 与质谱分析（MS）结合使用，能够在少量样本条件下分析原始亚细胞结构从而实现亚细胞蛋白质组学分析。以上研究说明，与单LCM 技术应用相比，多技术联用可提高捕获单个细胞的精确度、减少非目标组织沾染等局限性，可作为寻找肿瘤早期诊断、预后及药物治疗靶标的潜在工具［18］。

1.3 基于原位测序的空间转录组技术

锁式探针和滚动环扩增（rolling circle amplification，RCA）的ISS 方法已被应用于不同来源组织切片中基因转录本的检测。该技术首先使用挂锁探针以多重方式识别组织中的mRNA分子，并将其逆转录为cDNA；接着利用特定的挂锁探针与cDNA 杂交，在此基础上通过RCA 步骤生成滚环产物（rolling circle product，RCP），再通过连接锚定和检测探针进行测序，最终实现对特定mRNA 分子的检测分析［19］。TANG 等［20］在ISS 技术基础上开发了改进版原位测序（improved in situ sequencing，IISS），该方法采用一种新型探测和条形码方法结合先进图像分析进行高分辨率空间基因表达谱研究。IISS 编码策略虽然可提高信号强度和原位测序特异性并保持靶向空间转录组简化分析管道，但是仍可能受荧光团数量及显微镜光学衍射极限等限制。LEE等［21］进一步提出了荧光原位测序（fluorescent in situ sequencing，FISSEQ）技术，该方法在固定细胞时利用脱氧尿嘧啶（dUTP）将RNA逆转录为cDNA，并经过RCA 和测序处理来实现对多种RNA 定位模式非破坏性比较。与LCM 和FISH 相比，FISSEQ 可以不受所需探针数量限制且具有更好的灵活性，但存在测序深度低，会丢失一些丰度的转录本，不能提供单个细胞RNA完整信息等局限性［22］。GYLLBORG等［23］优化了锁式探针并开发了基于杂交的技术（hybridizationbased in situ sequencing，HybISS），相较于锁式探针，HybISS 方法采用一种新的组合条形码方法，不仅能更稳定地对样本进行分子检测，而且其原位空间解析基因表达的能力也得到了提升，能支持容纳更多的基因数量。LEE等［24］开发了直接RNA 靶向原位测序（dRNA-hybridization-based in situ sequencing，dRNA-HybISS）技术，该技术可直接检测RNA 获取基因序列，从而避免了基于cDNA 的原位测序所需的逆转录过程，极大提高其检测效率。近年来，利用dRNA-HybISS 的实验研究仍较少，可能与各实验室缺乏“即插即用”的仪器和软件解决方案相关，但其高效优势可能使其成为未来具有巨大潜力的细胞分类技术。

1.4 基于原位捕获的空间转录组技术

原位捕获技术是在原位捕获转录本的基础上进行异位测序，并允许对完整的转录组进行无偏分析的一项技术。2016 年，STÅHL 等［25］开发了能够利用引物微阵列对原位RNA 进行分析的基于原位捕获的空间转录组技术，通过将组织学切片定位到具有独特位置的引物微阵列芯片的条形码上，再利用二代测序技术对组织中的RNA 进行测序，可提供具有完整二维位置信息的高质量全转录组数据。尽管该法提供了空间分辨率的全转录组信息，其中每个捕获区域直径为100µm，含有1 007 个捕获点，但只能检测到10～40 个细胞，分辨率仍然较低。10×Genomics 公司收购该技术并进一步改进为10×Visium 技术，该技术的流程主要包括样本制备、文库构建和测序三大部分［3］。与STÅHL 等［25］开发的原位捕获空间转录组技术相比，10×Visium技术的每个捕获区域直径虽减小为55µm，但却含有5 000 个捕获点，这意味可以检测到更多的细胞，大大提高了空间分辨率和检测灵敏度［26］。Slide-seq 是继STÅHL 等后发布的第二个基于原位捕获和测序的高通量空间转录组学技术［27］。在该技术中，RODRIQUES 等［27］将组织切片贴附于直径为10µm 的磁珠表面，并通过芯片上的磁珠捕获组织切片中的mRNA，然后再逆转录为cDNA，并进行建库和测序以推断出RNA 的空间位置信息，从而获得组织的空间基因表达图谱，其灵敏度和分辨率较10×Visium技术得到很大提高。2019 年，VICKOVIC 等［28］开发了高清空间转录组（high definition spatial transcriptomics，HDST），它可以从直径仅为2 µm 磁珠阵列上的组织切片中捕获RNA，与Slide-seq技术相比，HDST具有更高的分辨率和灵敏度，可用于空间分辨基因表达分析。然而HDST和Slide-seq技术的分辨率仍比具有亚微米分辨率的光学显微镜低，且需要scRNA-seq 数据协助空间定位细胞类型［26］。空间条形码技术（spatial barcoding sequencing，Seq-Scope）是基于Illumina 测序平台的空间转录组技术。该技术流程主要分为两轮测序，首先对带有不同条形码的引物片段固相扩增形成簇后，进行第一次测序和成像以获得引物簇的序列和空间位置信息，然后利用引物簇捕获组织中的mRNA并进行逆转录后，进行第二次测序得到不同条形码对应的cDNA 序列信息，最后与第一次得到的位置信息结合从而获得组织不同部位细胞的转录组信息。该技术捕获的RNA条形码间的距离为0.5～0.8µm，可实现亚微米分辨率。Seq-Scope 具有快速、直接、精确且易于实施等优点，但其研究只关注于含有poly-A 的转录组，尚处于需进一步研发和完善阶段［29］。

2 空间转录组技术在消化系统肿瘤研究中的应用

2.1 空间转录组技术在肝癌研究中的应用

空间转录组技术在识别肝癌及其微环境的异质性方面发挥了重要作用，对其诊断、治疗、预后及分子生物标志物分析具有深远意义［30］。WU等［31］采用10×Genomics Visium 技术比较了肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）患者非肿瘤区域、边界区域及肿瘤区域的空间肿瘤微环境特征，发现具有纤维包膜的肿瘤细胞在正常组织侧的免疫细胞富集程度高于肿瘤组织侧，而无包膜的肿瘤细胞边界两侧组织内的免疫细胞分布更趋于复杂多变，这揭示了肿瘤纤维包膜与免疫微环境的异质性关系。同时，该团队还发现了CD47+和PROM1+的肿瘤干细胞（cancer stem cells，CSC）在HCC 中高度富集并与肿瘤的侵袭和迁移能力增强相关；三级淋巴结构（tertiary lymphoid structures，TLS）参与抗肿瘤免疫反应和潜在的免疫治疗反应，与肿瘤预后相关［32］。该团队将HCC-5的cluster-6中表达最高的前50 个基因当做一个新鉴别TLS 的基因集（命名为TLS-50），证实了TLS-50鉴定的TLS 结构在形态学与细胞构成上均与TLS 相符合。为探索TLS-50在HCC 中的临床意义，该团队还对TLS-50 评分与临床数据进行了相关性分析，发现TLS-50 的高评分与肿瘤直径和巴塞罗那临床肝癌分期相关，这意味着TLS-50 有望成为预测患者预后的新指标。该研究详细描述了HCC的空间异质性，为临床肝脏CSC靶向治疗提供新的研究方向，以及为在临床中评估患者预后提供了新的指标。

HCC 预后与其病理分型密切相关，其中粗梁-团块型HCC 预后极差［33］。FENG 等［34］通过单细胞测序结合空间转录组等技术手段发现粗梁-团块型HCC与B 细胞浸润和免疫球蛋白合成的体液免疫失调有关。该研究结果为基于病理分型的肝癌精准诊疗模式的发展奠定了坚实的理论基础，并为HCC 的临床诊治提供了新思路，具有重要而深远的临床意义。SAVIANO等［35］通过scRNA-seq 和空间转录组对小鼠的肝脏分区进行研究，结果发现Notch信号通路是参与人肝纤维化生态位中细胞相互作用的中心途径，进一步阐明了肿瘤上皮细胞与肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）之间的相互作用。癌症免疫治疗的主要难题之一就是肿瘤免疫微环境的空间异质性。XUE等［36］应用10×单细胞，空间转录组以及超多色免疫荧光等技术揭示了肝癌免疫微环境亚型和中性粒细胞的异质性。该研究利用单细胞测序阐明了5 种免疫微环境亚型的空间分布，结果提示2 个中性粒细胞亚群CCL4+TAN 通过招募肿瘤相关巨噬细胞和PD-L1+TAN 抑制CD8+T 的免疫功能从而促进肿瘤生长，该研究结果有望为肝癌的免疫治疗提供新的策略。空间转录组技术深度挖掘了肝肿瘤细胞及其纤维包膜、上皮细胞与不同免疫细胞亚群之间的关系，进一步揭示了肝癌及其微环境的异质性，为肝癌的病理分型、靶向治疗及预后评估提供新的研究方向。

2.2 空间转录组技术在胃癌研究中的应用

胃癌是我国肿瘤相关死亡的第三大常见原因［37］，术后高复发率是导致其高死亡率的重要原因［38］。胃癌微环境异质性对晚期患者的预后和治疗起着关键作用［39］。空间转录组技术可保留胃癌细胞空间信息，进一步揭示肿瘤内部的微环境异质性，可为其个体化精准医疗和预后分析提供新的见解。KUMAR等［40］运用scRNA-Seq与DSP技术，初步揭示在弥漫型胃癌中，Kruppel样转录因子（KLF2）表达水平上升，且KLF2 的表达和调节与浆细胞群的塑造密切相关，这为胃癌细胞亚群的鉴定提供了新的数据。此外，该研究还发现肿瘤成纤维细胞（CAFs）中INHBA 表达上调，且CAFs的标志物FAP表达增加；随着胃癌临床分期的升高，表达INHBA 和FAP 的CAFs 亚群数量也逐步增加，提示在不同CAFs 中INHBA-FAP 的高表达可能是预测胃癌预后不良的因子。在过去，空间转录组技术的研究主要集中在肿瘤本身，近年来在药物开发领域，空间转录组技术的应用更直观地揭示了新型药物对胃癌的作用靶点机制。AKIYAMA等［41］利用Visium空间基因表达平台发现PDGFRα/β 双重阻断可通过靶向逆转免疫抑制微环境，提高免疫检查点抑制剂在纤维化胃癌中的疗效。空间转录组技术虽在药物开发领域报道较少，但具有可识别肿瘤细胞和免疫细胞基因表达特征的优势，能为开发更有效的新型免疫治疗药物提供指导［2］。

空间转录技术可保留空间信息，而多技术联合可多维度深入探讨肿瘤细胞及其微环境的异质性［42］。DU等［43］应用空间转录组和scRNA-seq技术揭示了非萎缩性胃炎（non-atrophic gastritis，NAG）、萎缩性胃炎（atrophic gastritis，AG）到早期胃癌（early gastric cancer，EGC）的免疫微环境特征。该研究发现，NAG 中的淋巴细胞聚集面积最大，而AG 和EGC 中的淋巴细胞聚集面积减小，这表明NAG 的免疫防御功能最强。在此过程中，不同胃状态阶段的淋巴T 细胞和B 细胞的组成和比例也呈现出不同特点。有研究发现，在AG和EGC 阶段发现了NAG 阶段中未出现的细胞毒性T细胞和耗竭性T 细胞，说明早期肿瘤进展伴随着免疫反应的发生；而对于B 细胞，其数量和多样性较少主要与SOX5 的转录抑制有关［44］。该研究通过多组学技术深入探究了不同胃状态免疫微环境特征，有助于临床医师更好地认识并干预ECG的进展，对制定个性化治疗方案具有重要意义。

研究表明，胃癌可在营养匮乏的环境中仍能满足其生长和增殖的需求，且其可通过调控新陈代谢相关通路实现免疫逃逸［45］。CHAPMAN 等［46］利用scRNAseq技术发现了胃癌TME中基质细胞的转录重编程产物肿瘤特异性细胞外基质（extracellular matrix，ECM），而ECM 促进癌细胞的增殖。该研究虽然有助于深入了解胃癌相关的细胞转录调控重编程，但是无法提供胃癌微环境中特定细胞代谢物和脂质的空间分布及变化。基于此，SUN 等［47］利用空间分辨代谢组学和空间分辨脂质组学以及10×Genomics 的空间转录组测序对胃癌组织冷冻切片进行分析，结果发现精氨酸和脯氨酸在胃癌组织中均表现出高度异质性的空间分布，通过下调精氨酸和脯氨酸合成的ASS1、ALDH18A1 和PYCR 可抑制癌细胞生长，这为抗癌药物的开发提供了新的见解。脂质代谢的重编程被认为是肿瘤细胞增殖的标志［48］。胆固醇是脂质的重要代谢产物。有研究发现胆固醇合成酶基因HMGCS1和HMGCR以及调控胆固醇合成途径的SREBF2基因在肿瘤和淋巴组织中均升高并促进胆固醇的合成，而胆固醇在肿瘤微环境中富集可抑制T 细胞分化，诱导T细胞功能衰竭［49］。胆固醇合成在转录水平上调可能是免疫细胞不能有效抑制胃癌生长的原因之一。该研究通过代谢组学和脂质组学以及空间转录组学等多组学技术全面而系统地描绘了胃癌细胞内代谢产物和脂质成分在肿瘤微环境中的空间分布情况，为深入理解肿瘤形成机制提供了新视角，也为未来开展相关临床应用奠定了坚实基础。

2.3 空间转录组技术在结直肠癌研究中的应用

肿瘤微环境中肠道菌群、炎症及缺氧与结直肠癌发生发展密切相关［50］。空间转录组技术通过检测不同基因标志物的表达以及不同结直肠癌结构的免疫微环境，进一步阐释其恶变机制，能为结直肠癌靶向药物开发与临床用药提供新见解。OZATO 等［51］整合单细胞与空间转录组技术，对结直肠癌组织的TMEs中各免疫细胞功能进行探索，结果发现具有转移性的结直肠癌细胞可通过分泌人白细胞抗原G（HLA-G）将巨噬细胞转化为分泌型磷蛋白SPP1+巨噬细胞，而SPP1+巨噬细胞则通过细胞因子如IL-10 抑制CD8+T细胞的免疫活性，进而发挥抑制肿瘤免疫作用，提示肿瘤免疫微环境参与调节结直肠癌生长并影响其进展。同时，该研究还发现HLA-G基因敲除可促进体内肿瘤免疫，SPP1+巨噬细胞和分泌高水平HLA-G 的癌细胞可能是治疗结直肠癌的潜在靶点。另一项研究结合空间DSP 与成像质谱流式（IMC）进一步揭示CD47-SIRPα 轴可能是结直肠癌的一个潜在免疫治疗靶点［52］。QI 等［53］利用Visiun 技术发现肿瘤特异性FAP+成纤维细胞和SPP1+巨噬细胞共表达，其相互作用可能有助于细胞外基质重塑并促成纤维增生微环境，提示对共表达免疫因子进行评估具有积极意义。

结直肠癌患者长期生存的主要障碍仍然是肝转移，空间转录组技术可通过鉴定结直肠癌肝转移周边的TME，进而对肿瘤分期、预后及抗癌策略进行评价。WU 等［54］对24 个结直肠癌肝转移样本进行Visium 和scRNA-seq 测序，在结直肠癌肝转移的空间图谱基础上，发现转移部位存在高代谢活化的MRC1、CCL18、M2 样巨噬细胞，提示这些可能是潜在的靶向治疗分子。此外，FAP+成纤维细胞和SPP1+巨噬细胞的高浸润也提示与预后有关［53］。 WOOD 等［55］发现，相较于预后不良患者，在长期幸存的结直肠癌肝转移瘤患者中，侵袭组织边缘主要富集Ⅱ型IFN 信号传导和MHC-Ⅱ类抗原呈递的免疫细胞群，提示转移瘤的高免疫浸润可能与改善癌症特异性生存率有关。WANG 等［56］利用scRNA-seq 和Visium 测序技术也发现CXCL13 T细胞高浸润的结直肠癌肝转移患者预后良好，与上述研究结果一致。在结直肠癌治疗领域，WU 等［54］通过观察NAC 治疗后的ECM 重塑，发现病变进展/病变稳定（PD/SD）肿瘤和部分缓解（PR）肿瘤NAC后免疫细胞变化不同。另一项研究［57］借助ST相关技术发现，TAM中M0和M1表型参与结直肠癌炎症反应，TAM重分化为M1 表型可作为一种有效的抗癌策略，该研究同时提出Wnt信号通路可调节巨噬细胞的促炎或抗炎表型改变。这提示靶向某些TAM 亚群与重编程相结合可能有益于结直肠癌治疗，为其临床治疗策略提供新思路。

2.4 空间转录组技术在其他消化系统肿瘤研究中的应用

食管癌是源自食管上皮的恶性肿瘤，主要分为食管鳞状细胞癌和食管腺癌两个亚型。食管鳞状上皮细胞癌前病变是食管鳞状细胞癌的前体，但由于缺乏相关分子标志物，其是否发展为食管鳞状细胞癌尚不清楚。空间转录组技术的应用有效揭示了食管鳞状上皮细胞癌前病变的相关风险预测因子，为食管鳞状细胞癌的早期诊断与治疗提供便利。LIU 等［58］对19个患者样本进行了空间转录组分析，发现随着食管鳞状细胞癌的发展，TAGLN2基因表达水平显著增加，而CRNN（Cornulin）通过调节细胞增殖抑制TAGLN2基因表达，在食管鳞状上皮细胞癌前病变中，TAGLN2和CRNN 可作为评估食管鳞状细胞癌发展的风险候选指标。

胰腺癌被称为“癌中之王”，其中胰腺导管癌是最常见的恶变类型。目前，胰腺癌的诊治仍是巨大挑战，虽然免疫疗法在多实体瘤中取得显著成就，但对胰腺癌患者尚未取得明显效果［59］。近年来，空间转录组技术对不同条件下的胰腺导管癌中的TME 进行了深入探索，为其诊疗提供了新思路，例如MONCADA等［60］结合微阵列的空间转录组技术和scRNA-seq 技术，对胰腺不同组织区域的细胞亚群进行鉴定，发现胰腺导管癌患者存在4 个导管细胞亚群，其中MHC Ⅱ类基因的抗原提呈细胞通过促进T 细胞活化进而对TME 中的炎症反应进行调节以缓解胰腺导管癌的应激反应，这可能是延缓胰腺导管癌病程发展的有效策略之一。缺氧是胰腺导管癌等实体肿瘤的重要特征，它与肿瘤侵袭、转移和耐药性有关［61］。SUN等［62］利用10×Visium 空间转录组技术首次阐述了缺氧微环境诱导胰腺导管癌空间转录组变化，结果显示，相较于对照组，缺氧组的肿瘤细胞亚组相应减少且在第6亚组的细胞表现出高增殖力与高侵袭力的特点，此外，缺氧基因LDHA表达增加可激活P13K信号通路，从而调节胰腺导管癌在缺氧条件下的分化、增殖、代谢和应激以促进其侵袭和转移，这提示P13K抑制剂为治疗胰腺癌提供了新的候选药物，但尚未有验证研究报道。

3 小结

空间转录组学是用于研究肿瘤及其微环境异质性的前沿技术，在消化系统肿瘤中，空间转录组技术的应用不仅可获取基因表达的空间特征，揭示肿瘤细胞异质性起源和发生发展中的致病机制、潜在药物靶点及新的生物标志物，还可以探索肿瘤微环境中不同类型的肿瘤细胞与免疫细胞、间质成分等相互作用关系，并准确定位及鉴别具有特定功能和表型特征的亚群体细胞，可能是探索肿瘤微环境异质性核心药物靶点的潜在工具。但是，空间转录组技术也存在一些局限性，如空间转录组技术在空间分辨率上无法达到单细胞水平；获得的样本数据集可能不够全面，可能是因为不同方向和层面来源的切片存在差异，测序过程中所选切片中空间转录组图谱能否全面覆盖多种器官及其变化仍有待明确；经济成本和操作复杂性等也限制了空间转录组技术的广泛应用。目前，多组学技术联合应用成为应对空间转录组技术局限性的策略，包括空间转录组技术与代谢组学相结合，以更全面了解肿瘤异常代谢与特定基因表达程序的关联性；空间转录组技术结合蛋白质组学，能了解肿瘤细胞中基因表达程序变化，观察基因编码蛋白质在细胞内部及周围环境中分布情况，在涉及肿瘤信号通路、代谢途径以及其他重要生物过程等方面也具有显著优势。总体而言，目前空间转录组技术主要应用于基础研究，在临床实践中尚未推广，但随着空间转录组技术不断完善与优化，相信其将在肿瘤医学领域方面提供更多的防治手段，发挥更大作用。