贵州荞麦重要种质的遗传多样性分析及分子身份证构建

关键词 荞麦； SSR 标记； 毛细管电泳； 遗传多样性； DNA 分子身份证

中图分类号 S517.102.4 文献标识码 A 文章编号 1000-2421（2024）03-0148-10

荞麦属于蓼科（Polygonaceae）荞麦属（Fagopy⁃rum Mill）双子叶植物，营养丰富，有“百谷之王”之称［1］。贵州是中国荞麦的起源地和主产区之一，有苦荞（Fagopyrum tataricum （L）. Gaertn.）、甜荞（F. es⁃culentum Moench）和金荞麦（F. cymosum）3 个种，主要以苦荞种植为主［2-3］。荞麦为贵州省优势特色作物品种，是贵州发展山地特色高效农业的支柱产业之一［4］。长期以来，贵州毕节市、六盘水市等荞麦主产区存在自繁留种、品种混杂和栽培管理粗放等问题，严重影响了荞麦产量和品质［5］。因此，基于分子标记技术开展荞麦种质资源遗传多样性分析和DNA指纹鉴定，对加快荞麦遗传育种和新种质知识产权保护进程，进而促进荞麦产业发展具有重要意义。

SSR（simple sequence repeat，简单重复序列）分子标记操作简单、多态性丰富、重复性好，在近似品种的鉴别方面优势显著，是构建指纹图谱的重要标记［6-7］。现有的使用SSR 分子标记技术对荞麦种质资源遗传多样性分析和指纹图谱构建的研究大多集中在苦荞，并且没有对贵州省荞麦资源亲缘关系及DNA 分子身份证构建等的系统研究［8-9］。DNA 分子身份证是在指纹图谱基础上，将种质特征数字化，使每个种质都拥有自己的独特代码，检索品种时更加方便和直观［10-11］。近年来，使用SSR 标记方法开展种质亲缘关系分析和DNA 分子身份证构建已非常普遍［12-13］。

目前，国内外未见利用SSR 分子标记结合毛细管电泳技术用于荞麦的研究报道，本研究拟采用SSR 标记对贵州省60 份荞麦种质开展遗传多样性分析，并构建其DNA 分子身份证，旨在揭示贵州省荞麦种质资源间的亲缘关系，为贵州省荞麦种质的遗传育种、种质保护提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

苦荞、甜荞和金荞3 个种共60 份试验材料，保存单位为贵州师范大学（54 份）和六盘水职业技术学院（6 份）（表1）。51 份种质由贵州师范大学荞麦产业技术研究中心提供种子，在营养盘播种20 d 后进行采样，其余9 份分别取自贵州省六盘水市水城区玉舍镇和贵州师范大学安顺市西秀区双堡镇荞麦种植基地。采样时随机选取10 株，采集新鲜幼嫩叶片，混合后包入锡箔纸，迅速放入液氮，带回实验室保存于-80 ℃冰箱备用。

1.2 植物DNA的提取

采用DNA 提取试剂盒DP320（天根，北京）提取所有供试样品DNA，提取完成后采用1% 琼脂糖凝胶电泳检测DNA 完整性，采用全波长酶标仪（ThermoFisher Scientific， MA， USA）检测其浓度与纯度，质量合格后将其稀释至约35 ng/μL，置于-20 ℃保存。

1.3 SSR引物对来源

根据SSR 引物具有通用性强的特点，查阅普通荞麦、苦荞SSR 标记研究的相关文献［14-17］，共搜集挑选出100 对引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.4 SSR-PCR

随机挑选5 个DNA 模板对100 对引物进行PCR扩增，通过2% 琼脂糖凝胶电泳初步筛选出多态性引物，再采用Qsep 100TM全自动核酸蛋白分析仪（杭州厚泽生物科技有限公司）进行毛细管电泳检测。用于引物筛选的DNA 材料包括采用黔黑荞（QM01）、贵米苦荞55 号（QM14）、凉K19-10（QM28）、贵红花甜荞2 号（QM42）和九江苦荞（QM55）。

PCR 扩增反应采用10 μL 体系：模板基因组DNA 1 μL，正、反向引物各1 μL，2×Taq PCR MasterMix 5 μL，ddH2O 补充至10 μL。2×Taq PCRMaster Mix 来源于北京天根生物科技有限公司（TIANGEN）。SSR-PCR 扩增反应程序：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s，最适退火温度60 ℃反应30 s，72 ℃反应30 s，共35 个循环；72 ℃延伸7 min；4 ℃保存。

将筛选出的16 对多态性丰富的SSR 引物（表2）进行毛细管电泳，毛细管电泳所使用的卡匣为S1 高分辨率卡匣，分子大小标准参照物为1K Size marker（深圳鼎泽扬生物科技有限公司生产）。使用8% 变性聚丙烯酰胺凝胶分离PCR 产物，电压为170 V，120 min 后开始银染，随后拍照留存。

1.5 数据统计与分析

毛细管电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果均按获得的DNA 分子质量进行统计，根据片段位置区分，同一位置有条带记为1，无条带记为0。将统计结果构建成数据矩阵，用Popgen32 软件计算等位基因数、有效等位基因数、观察杂合度和Shannon’s 指数；用Power Marker v3.25 软件计算多态信息含量（PIC）；NTSYS pc 2.10e 分析软件计算相似系数，并按UPMGA 方法构建亲缘关系树状图；通过条形码和二维码生成器（http：//qr-batch.com/）构建供试种质分子身份证。

2 结果与分析

2.1 SSR引物对筛选

提取的60 份荞麦种质的基因组DNA 质量浓度为38～122 ng/μL，OD₂₆₀/OD₂₈₀ 在1.7～2.0，均满足后续PCR 试验的要求。利用100 对引物对随机选取的5 个荞麦品种进行扩增，筛选出扩增产物条带清晰稳定的40 对引物（图1），对这40 对引物进行多态性检测，共筛选出多态性较高的16 对（表2）。以引物SSR98 为例，它在5 个品种中扩增产物毛细管电泳图见图2，可见该引物具有较高的扩增多态性。

2.2 荞麦的遗传多样性分析

通过Popgene32 对毛细管电泳结果统计的0、1数据进行统计分析，结果（表3）显示，16 对SSR 引物在60 份荞麦种质中共检测出174 个多态性片段，最少的3 个（SSR72、SSR98），最多的24 个（SSR29），平均为10.875 个，基因片段大小集中在102～508 bp。单个引物的等位基因数为1.944～2.000，均值1.993；有效等位基因数为1.162（SSR82）～1.647（SSR13），均值1.317；Nei’s基因多样性指数变幅为0.126（SSR36）～0.361（SSR13），平均值0.206；Shannon信息指数变幅为0.231（SSR36）～0.532（SSR13），平均值0.337；多态信息含量在0.309～0.925，均值为0.693。以上结果表明，筛选出的引物多态性高，贵州省荞麦资源遗传多样性丰富。

2.3 荞麦种质的聚类分析

根据UPGMA 法对60 份荞麦种质进行聚类分析，进而获得不同荞麦品种间的遗传关系树状图（图3）。在Dice 系数0.374 处荞麦种质可分为3 组：其中A 组包含47 份苦荞品种；B 组包含4 份金荞麦的品种；C 组包含9 份甜荞品种。Dice 相似系数0.484 将苦荞组更细分为A1、A2 2 个小组，A1 组主要包括：贵州省威宁县农业科学研究所毛春等选育的黔苦荞系列、贵州师范大学陈庆富等通过小米荞（属薄壳苦荞）与晋荞2 号等有性杂交产生的新品系（含贵米苦荞和黑米苦荞系列）；A2 组包括：六盘水职业技术学院张清明等选育的六苦荞系列，通过苦荞和金荞麦杂交育成的贵金苦荞系列。这表明贵州地区的不同苦荞种质具有遗传近缘性和差异性。

2.4 毛细管电泳鉴定荞麦种质可靠性

本研究分别采用毛细管和聚丙烯银染显影技术，基于相同的材料和引物对2 种方法的检测结果进行比较，以SSR-13 为例展示2 种检测方法的结果（图4 和图5）。毛细管电泳由于较高的灵敏度，共扩增出174 条多态性条带，而聚丙烯酰胺凝胶电泳仅扩增出72 条多态性条带，60 份荞麦种质的Dice 系数变幅为0.333～0.974，平均0.699。在Dice 系数约为0.654处，苦荞、金荞麦和甜荞分别聚为A、B 和C 3 组（图6）；在Dice 系数约为0.702 处分为A1 和A2 2 个小组，43 个苦荞种质聚在A1 组，A2 组仅包含大苦1 号和3 个贵金苦荞品种。

2.5 种质DNA分子身份证构建

在16 对多态性引物中，SSR29、SSR36、SSR77、SSR82、SSR55、SSR13 和SSR38 的多态性指数较高，鉴别能力较强，其中SSR29 引物鉴别能力最强（表4），可单独鉴别39 个种质，鉴别率为65%。经过筛选，所有供试种质通过SSR29、SSR36、SSR773 对SSR 引物组合即可被完全区分开，可以用来构建荞麦种质的DNA 分子身份证。将选用的3 对SSR 引物按照SSR29、SSR36、SSR77 固定顺序，以每个种质在对应的引物扩增的“0”和“1”矩阵进行串联排列，用以表示DNA 分子身份证字符串，最后将种质的编号、保存单位及身份证号等信息导入二维码生成器中以得到二维码DNA 分子身份证，图7为贵米苦荞55 号和九江苦荞的分子身份证。

3讨论

SSR 分子标记是国际植物新品种保护联盟（UPOV）认可的DNA 指纹数据库构建的首选标记，其扩增产物主要通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）和毛细管电泳（CE） 2 种方法进行检测［18-19］。前期利用SSR 分子标记技术对荞麦种质资源的研究主要集中在苦荞，扩增产物均由聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测［20］。本研究采用SSR 分子标记结合毛细管电泳技术进行荞麦种质资源鉴定。

3.1 荞麦种质DNA分子身份证的构建

种质资源DNA 分子身份证与DNA 指纹图谱能够区分不同的品种，但二者又有所不同。分子身份证是指纹图谱数字化后的结果，分子身份证利用特定的数字编码成数字串，辅以条形码或者二维码可以实现种质资源快速识别，现已作为一个标准应用于品种的快速识别和鉴定［21-22］。

以往对于贵州省荞麦种质资源的研究均为利用SSR 分子标记技术构建指纹图谱对荞麦种质资源进行鉴定［23］，没有关于DNA 分子身份证构建的研究。本研究以SSR 分子标记技术为核心，采用毛细管电泳技术作为分析手段，实现荞麦DNA 分子身份证制作的高精度及高通量；结合供试荞麦的保存单位等基础信息，利用3对SSR引物组合构建了60 份荞麦种质资源的条形码和二维码共2 种DNA 分子身份证，克服了指纹图谱人工对比繁琐、低效等问题，不仅可以达到快速鉴定的目的，而且有助于知识产权的保护，这对荞麦种质的识别和鉴定具有十分重要的意义。

3.2 贵州荞麦的遗传多样性和聚类分析

本研究利用16 对SSR 引物分析荞麦60 份种质，使用毛细管电泳法检测出174 个多态性位点，每对引物平均10.875 个，多态信息含量变幅为0.309～0.925，平均为0.693，表明贵州省荞麦种质资源具有丰富的遗传多样性，这对于今后荞麦品种改良以及挖掘更多的优良基因有重要意义。王晋雄［24］利用47对SSR 引物对甘肃省96 份荞麦种质资源进行了遗传多样性分析，PIC 平均值为0.590；马名川等［25］使用13 对SSR 引物对山西省49 份苦荞资源进行了遗传多样性分析，PIC 平均值为0.390，均比本研究低，这可能与材料和SSR 引物的选择不同以及检测方法有关。

聚类分析中苦荞、甜荞和金荞麦各聚为一类，在相似系数约为0.484 处苦荞进一步聚为A1 和A2 两个小组。所有种质遗传相似系数变幅在0.032～0.918，贵甜4 号和黑米2 号的遗传相似系数最小，黑米41-2 和黑米202203 遗传相似性系数最大。根据王贵等［26］对沙子空心李的研究，遗传相似系数能够反映群体间的亲缘关系，贵甜4 号和黑米2 号的遗传相似系数最小，二者之间亲缘关系最远，可以为荞麦育种时亲本材料的选择提供参考。此外，本研究发现来自不同地区同名的品种并没有聚在同一类，如分别来自贵州师范大学荞麦产业技术研究中心保存和贵州省六盘水市水城区玉舍镇种植的六农1 号、六苦荞3 号，这表明荞麦品种可能存在换种现象，其原因有待进一步研究。金荞麦作为重要的药饲兼用植物资源，越来越受到人们的关注，但目前未有针对金荞麦基因组开发的SSR 引物。在本研究共收集了4份金荞麦种质，数量较少，在引物筛选时并未将其选入，但筛选出的16 对SSR 引物同样适用于金荞麦种质的分析鉴定。从聚类图中可看出种质间遗传关系的远近，对于贵州省荞麦资源进一步的保护和利用具有重要意义。

总之，本研究开发的高效性SSR 分子标记能够有效地鉴定贵州荞麦重要种质的遗传多样性，并且可用于构建分子身份证。未来可将筛选到的SSR 标记应用于更广泛的荞麦种质的多态性鉴定和分析中，以促进荞麦的种质创新和种质保存。

致谢：感谢贵州师范大学荞麦产业技术研究中心陈庆富教授和六盘水职业技术学院张清明老师提供试验材料。

（责任编辑：张志钰）